乙肝病毒DNA的实验室检测.ppt

LOREM IPSUM DOLOR,乙肝病毒DNA的实验室检测 袁立云,1、荧光定量PCR技术 2、乙肝病毒的感染 3、HBV-DNA与临床,荧光定量PCR技术,荧光定量PCR技术,Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶链式反应，是一种DNA的快速扩增技术。PCR技术通过两个短的称为引物的DNA小片段和一种耐热酶（TaqDNA聚合酶）的作用，经过高温变性、低温退火、适温延伸三个步骤在3个小时内反复循环25-30次，把特定的DNA片段扩增1000万倍。 每个PCR体系含4种主要成分：含有待扩增序列的DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、脱氧核糖核酸三磷酸（dNTP）,实时荧光定量PCR技术，是指在反应体系中加入荧光标记，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，通过标准曲线对PCR终产物的分析，最终实现对未知的起始模版进行定量分析的一种技术，是迄今对已知基因序列的核酸测定中最灵敏的方法。,荧光定量PCR技术,PCR 反应过程,d.NTPs,Taq 酶,Primers,反应组分,变 性,延 伸,重 复,退 火,循环2 4个拷贝,循环3 8个拷贝,荧光定量PCR原理,插入染料法 SYBR Green I 杂交探针法(最常用) TaqMan,TaqMan探针,d.NTPs,Taq酶,Primers,反应体系,变 性,l,退 火,1. 链取代,2. 水 解,3. 聚 合,4. 检测荧光,l,乙肝病毒的感染,乙肝病毒的感染,（一） 乙型肝炎病毒结构及特点,HBsAg：是HBV感染的主要标志 HBsAb：保护性抗体 HBcAg：仅存于感染的肝细胞核内， 一般不存在于血循环中 HBcAb: 非保护性抗体，HBcAb-IgM 提示HBV处于复制状态 HBeAg：HBV复制及强感染性的指标 HBeAb：有一定的保护作用，预后良好,乙肝病毒的感染,（二） HBV-DNA与“两对半”,1. “两对半” ：机体的免疫反应状态；,2. “携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不能 反应体内病毒复制水平与感染程度。,FQ-PCR：检测的是HBV本身的遗传物质DNA，是 病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。,3. 血清学指标()不能排除HBV感染。,乙肝病毒的感染,5.HBeAg阳性标本HBV DNA检出率90左右 HBeAg与HBV DNA有着良好的相关性,4. 也可能出现HBsAg()，HBV-DNA()。,乙肝病毒的感染,乙肝病毒的感染,慢性HBV感染分期及相关实验室检测指标,鲁凤民，庄辉，乙型肝炎实验室诊断研究进展 2009,HBV-DNA与临床,HBV DNA检测的临床意义,HBV DNA是HBV存在最直接的依据 HBV DNA是HBV复制的标志 HBV DNA是患者具有传染性的标志 HBV DNA对乙肝两对半起补充作用 HBV DNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标 HBV DNA可检测出隐匿性慢性乙型肝炎,有利于献血员窗口期病毒核酸的筛查和早期诊断,提供直接证据缩短“窗口期”,HBV DNA检测的临床意义,调查表明并不是所有“大三阳”的病人都处于HBV复制期，具有传染性；也不是所有“小三阳”的病人HBV都无复制。因此，要准确知道HBV是否处于复制状态，最准确的方法还是通过检测HBV DNA来决定。,HBV DNA检测的临床意义,HBV DNA检测的临床意义,HBsAg和HBeAg均阳性而HBV DNA阴性？,干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制受抑制。 PCR所用引物相应的DNA序列发生突变，此引物与突变DNA不能配对结合。 病毒DNA整合于宿主肝细胞染色体而血中游离HBV DNA很少或缺乏。,目前尚无一种能迅速、直接杀死清除乙肝病毒的药物，最好的抗病毒药物疗效也仅能达到50左右。 目前国际医学界公认的治疗慢性乙肝有确切疗效的抗病毒药物主要有两大类： 干扰素：重组人-1b干扰素、- 2a、 -2b干