β-葡聚糖酶活性测定.doc

-葡聚糖酶活性测定-葡聚糖是由葡萄糖单体通过-1，3和-1，4糖苷键连接而成的D型葡萄糖聚合物，它主要存在于单子叶禾本科谷实中的糊粉层和胚乳细胞壁中。-葡聚糖酶属于水解酶类，能有效地降解-葡聚糖分子中的-1，3和-1，4糖苷键，使之降解为小分子。由于在饲料中，大麦的-葡聚糖含量较高，难以被单胃动物消化利用，而且对饲料中各种养分的消化利用具有明显的干扰和抑制作用，成为麦类饲料中的抗营养因子。在饲料中添加-葡聚糖酶，能有效地消除-葡聚糖的抗营养作用，促进饲料中各种养分的消化和吸收利用，增进畜禽健康。在啤酒生产中，添加-葡聚糖酶可以加快麦汁和啤酒的过滤速度、提高麦汁得率、增加可发酵糖的含量。此外，-葡聚糖酶在造纸工业、日化工业等其它许多方面也有着广泛的应用，对-葡聚糖酶的研究将越来越受到人们的重视。-葡聚糖酶活力的测定方法主要有3种：还原糖测定法（分光光度法）、粘度测定法和底物染色法。其中还原糖测定法简便实用，比较准确，而且结果重复性好，是广泛使用的一种酶活测定方法。其原理是：-葡聚糖酶能将-葡聚糖降解成寡糖和单糖，其具有的还原基团在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应，显色的深浅与还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中-葡聚糖酶的活力成正比，因此，可以利用比色测定反应液的吸光度值来计算还原糖的生成量，从而得出-葡聚糖酶的活力。但在该测定方法的具体操作中存在一些影响酶活力测定结果的因素，本文即对还原糖法测定-葡聚糖酶活力的几个重要影响因素进行研究，并得出最佳测定条件。1 材料与方法1.1 菌株与培养基1.1.1 发酵产酶菌株黑曲霉（Aspergillus niger）A47菌株，由本实验室保藏。1.1.2 固态发酵培养基麸皮70 g、米糠27 g、NH4NO3 2.95 g、微量元素液 0.05 ml、蒸馏水100 ml，pH值5.0，121 灭菌20 min。微量元素液的组成为：2 mol/l HCl溶液 5 ml、FeSO4 2.5 g、MnSO4H2O 0.98 g、ZnCl2 0.83 g、CoCl2 1.0 g、蒸馏水100 ml。1.1.3 发酵培养条件250 ml三角瓶装10 g培养基（干料计），接种量为每瓶0.5 ml孢子悬液(1.0107 cfu/ml)，发酵温度30 ，培养48 h。1.2 试剂与溶液1.2.1 -葡聚糖溶液准确称取0.7 g -葡聚糖(Amresco)，加入5 ml无水乙醇润湿，再加入80 ml缓冲液，同时缓慢加热直至-葡聚糖完全溶解，冷却至室温，用缓冲液定容至100 ml，底物溶液4 保存，2 d内用完。1.2.2 葡萄糖标准贮备溶液(10 mg/ml)称取烘干至恒重的无水葡萄糖1 g，精确至0.1 mg，用水溶解并定容至100 ml。1.2.3 葡萄糖标准溶液分别吸取葡萄糖标准贮备溶液0.00、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50 ml于10 ml容量瓶中，用水定容至10 ml，盖塞，摇匀备用。1.2.4 DNS试剂称取3，5-二硝基水杨酸10 g，置于约600 ml水中，逐渐加入氢氧化钠10 g，在50 水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸钾钠200 g、苯酚(重蒸)2 g和无水亚硫酸钠5 g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1 000 ml，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7 d后使用。1.2.5 粗酶液的制备取5 g固体发酵曲于250 ml三角瓶中，加入缓冲液50 ml，振荡抽提1 h，过滤离心去除孢子后，4 保存备用。1.2.6 缓冲液乙酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲配制液见叶宝兴主编生物科学基础实验（2005）。1.3 标准曲线的制作方法按表1规定的量，分别吸取葡萄糖标准溶液、缓冲溶液和DNS试剂于各管中（每管做3个平行样），混匀。将标准管同时置于沸水浴中，反应10 min。取出，迅速冷却至室温，用水定容至25 ml，盖塞，混匀。在波长550 nm处测量吸光度。以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。1.4 酶活力测定方法取2支25 ml刻度具塞试管，分别加入1.5 ml 0.7% -葡聚糖底物溶液（由pH值5.6乙酸-乙酸钠缓冲液配制），置55 水浴中保温5 min。在其中一支试管中加入0.5 ml稀释酶样，混匀，置于55 水浴中准确反应30 min，加入3 ml DNS试剂至两支试管中，混匀。在另一支试管(空白管)中加入0.5 ml稀释酶样，同时将两支试管放入100 水浴中反应10 min，取出置于冷水中冷却至室温，加水定容至25 ml，盖塞混匀，在550 nm处测量酶样对空白的吸光度，计算酶活力。1.5 酶活力计算标准曲线：Y=AX+B。式中：Y吸光度；X葡萄糖量(mg)；A斜率；B截距。式中：1 000mg与g之间的换算系数；D酶液稀释倍数；180葡萄糖分子量；0.5测定所取酶液量(ml)；t反应时间（min）。-葡聚糖酶活力单位定义：在测定条件下，每分钟水解-葡聚糖产生1 mol还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量，定义为一个酶活力单位（IU）。2 结果与讨论2.1 最佳吸收波长的确定按照上述标准曲线的制作方法，分别测定在不同波长处的吸光度，制作标准曲线，见表2、图1。在分光比色测定时，波长的选择不仅需要考虑灵敏度，同时还要考虑数据的稳定性和重复性。试验测定了不同波长处的OD值制作标准曲线。由表2、图1可以看出，在相同的糖浓度时，随着波长的升高，OD值呈下降趋势。在波长为520 nm时，测得的OD值最大，灵敏度最高，但数据的稳定性较差;在波长为570 nm时，测得数据的稳定性较好，但是灵敏度偏低；在波长为550 nm时，测得的数据灵敏度较高，而且稳定性也较好。所以，最佳测定波长确定为550 nm。线性回归方程为：Y=0.4309X-0.0124，R2=0.998 3。2.2 葡萄糖沸水浴显色反应时间的确定分别以3种不同浓度的葡萄糖标准溶液与3 ml DNS试剂经沸水浴显色反应发现，沸水浴时间不同对显色反应结果影响较大，如图2所示，3种糖浓度反应结果相似，均为在14 min之间，反应速度较快，OD值增加幅度较大；510 min之间，反应趋于平缓，OD值增加缓慢；10 min以后，所测得的OD值基本保持不变，说明显色反应已经完全，因此，沸水浴显色时间确定为10 min。2.3 酶活力测定底物浓度的确定底物浓度是决定酶解反应速度的重要因素。测定-葡聚糖酶活力时底物浓度一般配制在0.5%0.8%之间，这个浓度范围达到了酶活力测定时底物过量的要求，既可保证酶和底物的充分反应，又可降低底物中小分子低聚糖对测定结果的影响，试验选用底物浓度为0.7%。2.4 酶活力测定反应时间的确定（见图3）不同种类的酶其线性反应时间的范围也不同，在酶的线性反应时间内测定的酶活力较为准确。在相同反应体系下，试验测定了酶解反应从5120 min时产生的还原糖的量。由图3可以看出，酶解产生的还原糖在前30 min内线性关系较好，产物生成量与反应时间成正比，在4080 min之间产物生成速率逐渐减慢，90 min以后产物生成量几乎不再增加。因此在530 min时处于一级反应阶段，产物生成速度一致，是酶活力测定的最佳时间，但反应时间短产物含量低时测定酶活力，会受到粗酶液中其它水解酶作用或底物纯度等因素对酶活力测定带来的干扰，选择产物生成量在2 mg以上的时间比较好，因此应选择30 min作为酶活力测定的反应时间。2.5 酶活力测定缓冲液种类的确定（见图4）缓冲液的种类和pH值对酶的活性影响较大，同一种酶在不同缓冲液和不同pH值时测定的活性不同。只有在某种缓冲液和某种pH值范围内才表现出最大活性。一般认为酶分子处在最适pH值时，其活性基团的解离状态最易与底物结合，而处在其它pH值时，改变了活性基团的解离状态，酶和底物结合减弱，活性就降低。由图4可知，试验测定了3种不同缓冲液体系条件下的酶活，随着pH值的增大，3种缓冲液体系测得的酶反应活性均呈现出先增加后下降的趋势，但乙酸-乙酸钠缓冲液体系测得的酶活力明显高于其它两种缓冲液体系。因此，在-葡聚糖酶活力测定时应选用乙酸-乙酸钠缓冲液体系。2.6 酶活力测定最佳pH值的确定选择乙酸-乙酸钠缓冲液体系，其它反应条件不变，改变缓冲液体系pH值进行酶活力测定，如图5所示，当pH值为5.6时，测得的OD值最大，酶活力最高。因此，酶活力测定应在pH值5.6时进行。2.7 酶活力测定反应温度的确定（见图6）酶解反应时的温度对酶反应速度影响较大，当其它条件不变时，温度每改变1 ，反应速度可相差10%以上。本文在乙酸-乙酸钠缓冲液pH值5.6时，测定了不同温度条件下酶解反应30 min时的产物生成量，如图6所示，随着温度的升高，测得的OD值呈现先升高后下降的趋势，在温度为55 时，测得的OD值最大，产物生成量最多，酶活力最高。因此，-葡聚糖酶活力测定应在55