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微生物的生长及其控制,1,第八章 微生物的生长及其控制,个体生长一个体繁殖一群体生长 群体生长=个体生长+个体繁殖,在微生物学中，凡提到“生长”时，一般均指群体生长，这一点与研究大型生物时有所不同。,2,第一节 测定生长繁殖的方法,测生长量,直接法,测体积 称干重,间接法,比浊法 生理指标法,含N量 含C量 DNA RNA等,一、测定生长量,3,（一）直接法 1、 测体积；这是一种很粗放的方法，用于初步比较用。 2、 称干重：可用离心法或过滤法测定，一般干重为湿重的10%-20%。 （1） 离心法： （2） 过滤法:,4,（二）间接法 1、比浊法 （1）采用McFarland比浊管进行测定。 这是用不同浓度的BaCl2与稀H2SO4配制成的10支试管，其中形成的BaSO4有10个梯度，分别代表10个相对的细菌浓度(预先用相应的细菌测定)。 （2）采用分光光度计进行测定。 在可见光的450650nm波段内均可测定为了对某一培养物内的菌体生长作定时跟踪，可采用不必取样的侧臂三角烧瓶来进行测定时，只要把瓶内的培养液倒人侧臂管中；然后将此管插入特制的光电比色计比色座孔中，即可随时测出生长情况，而不必取用菌液。,5,6,2、生理指标法： （1) 测含氮量： 根据其含氮量再乘以6.25，即可测得其粗蛋白的含量(因内中包括了杂环氮和氧化型氮)。 此法只适用于细胞浓度较高的样品，同时操作过程也较麻烦，故主要用于科学研究。 (2)测含碳量 ： (3)其他：,作为生长指标的那些生理活动项目，应不受外界其他因素的影响或干扰。,7,（三）测定微生物生长量应用举例 举例：可以通过细菌生长的快慢来判断某一条件是否适合。,8,二、计繁殖数,计繁殖数,直接法,比例计数法 血球计数板法,间接法,液体稀释法 平板菌落计数法,计繁殖数只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子。,9,1、涂片染色法 其计算公式如下： 每毫升原菌液含菌数=视野中的平均菌数X1平方厘米/视野面积X100X稀释倍数 2、比例计数法 3、 血球计数板法 计数室的总面积为1平方毫米，高0.1毫米，并具有一定刻度。,10,、,根据计数器小格数目的不同，可概括成两个换算公式： （1）16个中格X25个小格的计数器 每毫升原菌液含菌数=100小格内菌数/100X400X10，000X稀释倍数 （2） 25个中格X16个小格的计数器 每毫升原菌液含菌数=80小格内菌数/80X400 X10，000X稀释倍数,归纳成一个通式：每毫升原菌液含菌数=每小格平均菌数X4，000，000 X稀释倍数,11,4、电子自动计数器计数法,电子计数器不能区别其他颗粒。因此，菌悬液中应无其他碎片。,12,（二）间接法；又叫活菌计数法 1、 平板菌落计数法 可用倾注或涂布平板等方法进行。此法适用于各种好氧菌或厌氧菌。 一般操作为： 倾注法：10X稀释 1毫升； 涂布法：0.1毫升 1、2、3个平板累加（防止涂布器沾细胞）,在一个9厘米直径的培养皿平板上，一般以出现50500个菌落为宜。,13,此法是教学、科研、生产中最为常用的一种活菌计数法。但这种方法在操作时较烦琐且要求操作者技术熟练。其中最重要的是应使样品充分混合，并让每支移液管只能接触一个稀释度的菌液。其误差来源主要在于稀释和培养基温度。 为克服此缺点，国外已出现多种微型、快速、商品化的用于菌落计数的小型纸片或密封琼脂板，其主要原理是利用加在培养基中的活菌指示剂TTC(2，3，5氯化三苯基四氮唑)，它可使菌落在很微小时就染成易于辨认的玫瑰红色。,14,2、厌氧菌的菌落计数法 一般可用亨盖特滚管培养法进行 。 滚管技术的优点是：试管内壁上的琼脂层有很大的表面积可供厌氧菌长出单菌落，但试管口的面积和试管腔体积都极小，因而特别有利于阻止氧与厌氧菌接触。,15,小结： 以上介绍了若干测定微生物的生长量或计算繁殖数的主要方法。其中最常用的为称干重、测浊度（用分光光度计）、测含氮量、血球计数板法测总菌数以及用平板菌落计数法测活菌数等方法。必须指出的是：无论采用什么方法都有其优点和使用范围。所以，在使用前，一定要根据自己的研究对象和研究目的的不同，选用最合适的方法。,16,第二节 微生物的生长规律,一、微生物的同步生长 （一）相关定义 1、同步培养法：能使培养的微生物处于比较一致的生长发育在同一阶段上的培养方法，称同步培养法。 2、同步生长：通过同步培养，而使细胞群体处于分裂步调一致的状态，就称同步生长。 3、同步培养物：用同步培养法而得到的培养物。,17,（二）获得同步培养物的方法 1、环境条件诱导法 （1）温度 通过适宜与不适宜温度的交替处理之后可获得同步细胞。 （2）培养基成分控制 通过营养成分 通过抑制生物大分子合成的化学物质,18,（3）其他 对于光合细菌 对于不同步的芽孢杆菌,19,2、机械筛选法 （1）离心方法,20,（2）过滤分离法 将不同步的细胞培养物通过孔径大小不同的微孔滤器，从而将大小不同的细胞分开，分别将滤液中的细胞取出进行培养，获得同步细胞。,21,（3）硝酸纤维素 滤膜洗脱法,细菌,硝酸纤维素滤膜,营养液,子细胞,收集器,硝酸纤维素滤膜法,22,细菌的同步生长与非同步生长,细胞分裂杂乱,细胞分裂同步,时间,细胞数的对数,23,二、单细胞微生物的典型生长曲线（群体生长规律） （一）生长曲线的定义 定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线，称为生长曲线。 （二）典型生长曲线,24,微生物的典型生长曲线,延滞期,衰亡期,指数期,稳定期,25,1、延滞期 （1）特点 生长速率常数等于零。 细胞形态变大或增长。 细胞内RNA尤其是rRNA含量增加，原生质呈嗜碱性。 合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。 对外界不良条件如氯化钠溶液浓度、温度和抗生素等理化因素反应敏感。,26,（2）重要参数：迟缓时间（T） 定义：微生物在生长过程中，在实际条件下达到对数生长期所需时间与理想条件（即无迟缓期）下达到对数生长期所需时间之差。 计算方法,27,（3）产生原因 当微生物接种到一个新的环境时，暂时缺乏足够的能量和必需的生长因子，种子老化（即处于非对数生长期）或未充分活化，接种时造成的损伤等。,28,（4）人为缩短延滞期的措施 通过遗传学方法改变种的遗传特性使延滞期缩短。 利用对数生长期的细胞作为“种子” 尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大。 适当扩大接种量等方式缩短延滞期，克服不良的影响。,在发酵工业上，为缩短不利于提高发酵效率的延滞期，一般采用1/幻灯片 3210的幻灯片 31接种量。,29,30,2、指数期（又称对数期） （1）特点 生长速率常数R最大，因而细胞每分裂一次所需的时间（原生质增加一倍所需的时间）代时（增代时间或世代时间）最短。 细胞平衡生长，菌体各部分的成分十分均匀。 酶系活跃，代谢旺盛。,31,（2）三个参数 繁殖代数（n） x2=x12n 两边取对数：lg x2= lg x1+nlg2,lg x2 lg x1 n= =3.322(lg x2 lg x1) lg2,n= 3.322（lgx2 lgx1）,32,（2）生长速率常数（R） （3）代时（G）,R=,n,t2t1,=,3.322（lgx2 lgx1）,t2t1,G=,1,R,=,3.322（lgx2 lgx1）,t2t1,33,设大肠杆菌在接种时的细胞浓度为100个/ml，经400分钟的培养，细胞浓度增至10亿个/ml，求该菌的世代时间和繁殖代数。,n=23.1 代 G=17.3 分,34,（3） 影响因素 菌种：不同菌种，其代时差别很大。 营养成分：同一种微生物，在营养丰富的培养基上生长时，其代时较短，反之较长。 营养物的浓度：营养物的浓度既可影响微生物的生长速率，又可影响它的生长量。 培养温度,35,36,生长限制因子：凡处于较低浓度范围内可影响生长速率和菌体产量的某营养物，就称生长限制因子。,37,指数期实践意义,用作代谢、生理等研究的良好材料； 增殖噬菌体的最适宿主； 发酵工业中用做种子的最佳材料。,38,3、稳定期（又称恒定期或最高生长期） （1）特点 生长速率常数等于零。 在稳定期时，细胞开始贮存糖原、异染粒和脂肪等贮藏物；多数芽孢杆菌在此期开始形成芽孢；有的微生物在此期还开始合成抗生素等次生代谢产物。,39,（2）原因 营养物，尤其是生长限制因子的耗尽。 营养物的比例失调，例如C/N比不合适等。 酸、醇、毒素或过氧化氢等有害代谢物的积累。 pH值、氧化还原势等物理化学条件越来越不适宜等等,40,（3）重要参数： 总生长量 代表在某一时间里，通过培养所获得的微生物总量与原来接种的微生物量之差值 。 ,x为稳定期时的细胞干重（g/ml培养液）； x0为刚接种时的细胞干重； C0为限制性营养物的最初浓度（g/ml）； C为稳定期时限制性营养物的浓度,Y=,x x0,C0 C,=,C0,x x0,41,（4）实践意义 对以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物（SCP、乳酸等）为目的的某些发酵生产来说，稳定期是最佳的收获期；对维生素、碱基、氨基酸等物质进行生物测定来说，稳定期是最佳测定时期；此外，通过对稳定期到来的原因的研究，还促进了连续培养原理的提出和工艺、技术的创建。,42,4、衰亡期 （1）特点 在衰亡期中，个体死亡的速度超过新生的速度。因此，整个群体就呈现负生长（R为负值） 细胞形态多样。 （2）原因 主要是外界环境对继续生长越来越不利,43,生长曲线的实践意义,酒精生产过程中要设法缩短迟缓期，延长对数期，以便在最短的时间内获得最大产量； 医学上用G+染色鉴定病原菌，要采用对数期的菌体，因这时G+反应最典型； 工业上生产食品酵母，要在稳定期收集菌体，因这时菌体数目最大。,44,三、微生物的连续培养,45,1、分批培养：将微生物置于一定容积的培养基，经过培养生长，最后一次收获，就称单批培养或密闭培养。 2、连续培养 （1）定义：通过一定的方式使微生物可长期保持在指数期的平衡生长状态和恒定的生长速率上的一种培养方式。 （2）类型 恒浊器 ：根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器。,46,恒化器,47,装置 控制对象 培养基 培养基 生长速率 产物 应用 流速 范围,菌体密度 （内控制）,培养基流速 （外控制）,无限制 生长因子,有限制 生长因子,不恒定,恒定,低于 最高速率,最高速率,大量菌体 或与菌体 相平行的 代谢产物,不同生长 速率的 菌体,生产 为主,实验室 为主,恒浊器与恒化器的比较,48,（3）连续发酵 优点 A高效 B自控 C产品质量较稳定 D节约了大量的人力、动力、水和蒸汽，且使水、气、电的负荷均衡合理。,49,缺点 A最主要的是菌种易于退化。 B易遭杂菌污染。 C营养物的利用率一般低于单批培养。,50,四、微生物的高密度培养 1、定义：有时也称高密度发酵，一般指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上的生长状态或培养技术。 2、规律 （1）选取最佳培养基成分和各成分含量。 （2）补料 （3）设法提高溶解氧的浓度 （4）防止有害代谢产物的生成,51,第三节 环境对微生物生长的影响,影响微生物生长的主要因素有营养物质、水的活性、温度、pH和氧等.,52,一、营养物质 二、水的活性 微生物在生长过程中，对培养基的aw有一定的要求，每种微生物生长都有最适的aw。高于或低于所要求的aw值，都会通过影响培养基的渗透压力变化而影响微生物的生长速率。 三、温度 1、温度影响生长的机理 （1）影响酶活性。 （2）影响细胞膜的流动性。 （3）影响物质的溶解度。,53,2、生长温度三基点,生长速度,温度,停止生长,致死,最低,最高,最适,54,（1）最低生长温度：是指微生物进行繁殖的最低温度极限。 （2）最适生长温度：使微生物迅速生长繁殖的温度，叫最适生长温度。,最适生长温度的意义是某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度,变温培养的具体做法： 0小时 5小时 40小时 125小时 165小时,30,25,20,25,（3）最高生长温度：是指微生物生长繁殖的最高温度 界限。,55,四、氧气,56,1、专性好氧菌：必须在较高浓度的分子氧（0.2巴）的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为氢受体，具有超氧化物歧化酶和过氧化氢酶。 2、兼性厌氧菌：它是以在有氧条件下的生长为主，也可兼在厌氧条件下生长的微生物，有时也称“兼性好氧菌”。 3、微好氧菌：只能在较低的氧分压（0.01-0.03巴，正常大气中的氧分压为0.2巴）下才能正常生长的微生物。,57,4、耐氧菌：是一类可在分子氧存在下进行发酵性厌氧生活的厌氧菌。它们的生长不需要氧，但分子氧对它们也无害。 5、厌氧菌： 厌氧菌有以下几个特点： （1）分子氧对它们有毒，即使短期接触也会抑制甚至致死； （2）在空气或含10%CO2的空气中，它们在固体或半固体培养基表面不能生长，只有在其深层无氧处或在低氧化还原势的环境下才能生长； （3）生命活动所需能量是通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵等提供； （4）细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。,58,五、pH 1、pH的影响 主要作用在于：引起细胞膜电荷的变化，从而影响了微生物对营养物质的吸收；影响代谢过程中酶的活性；改变生长环境中营养物质的可给性和有害物质的毒性。 2、实践意义 不同种类的微生物有其最适的生长pH，同一微生物在其不同的生长阶段和不同的生理、生化过程中，也有不同的最适pH要求，这对发酵生产中的pH控制尤为重要。,59,3、生产上控制pH的措施,治标：根据表面现象而进行的直接、快速但不能持久的调节。 治本：根据内在机制所采用的间接、缓效但能发挥较持久作用的调节。,60,第四节 有害微生物的控制,一、几个基本概念 （一）灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌。,灭菌,杀菌：菌体虽死，但形体尚存 溶菌：菌体杀死后其细胞发生 溶化、消失,61,62,（二）消毒：是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体或动、植物有害的病原菌，而对被消毒的对象基本无害的措施。,63,（三）防腐：就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，即通过制菌作用防止食品、生物制品等对象发生霉腐的措施。 防腐的方法主要有： 1、低温 2、缺氧 3、干燥 4、高渗 5、高酸度 6、高醇度 7、加防腐剂,64,（四）化疗：即化学治疗，是指利用具有高度选择毒力即对病原菌具高度毒力而对宿主基本无毒的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该宿主传染病的一种措施。,总结：,65,二、控制微生物的化学物质 1、抗微生物剂 抗微生物剂是一类能够杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质，这类物质可以是人工合成的，也可以是生物合成的天然产物。 （1）抑菌剂： （2）杀菌剂 （3）溶菌剂,66,2、抗代谢物 在微生物生长过程中，常常需要一些生长因子才能正常生长，那么就可以利用生长因子的结构类似物干扰机体的正常代谢，以达到抑制微生物生长的目的。 3、抗生素 （1）作用机理：抗生素是由某些生物合成或半合成的一类次级代谢产物或衍生物，它们是能抑制其他微生物生长或杀死它们的化合物，它们主要是通过抑制细菌细胞壁合成、破坏细胞质膜、作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化、抑制蛋白质和核酸合成等方式来抑制微生物的生长或杀死它们。,67,（2）抗性菌株的特点 抗性菌株具有以下特点： 细胞质膜透性改变，阻止某些药物进入细胞； 药物作用靶改变； 合成了修饰抗生素的酶，使被修饰的抗生素失去了抗菌活性； 抗性菌株发生遗传变异，发生变异的菌株导致合成新的多聚体，以取或部分取代原来的多聚体。,68,（3）克服抗药性的方法 第一次使用时的药物剂量要足； 避免在一个时期或长期多次使用同种抗生素；不同的抗生素（或其他药物）混合使用； 对现有抗生素进行改造； 筛选新的更有效的抗生素，这样既可以提高治疗效果，又不会使细菌产生抗药性。,69,三、控制微生物的物理因素 1、高温灭菌 （1）衡量灭菌效果的指标： 十倍致死时间（D）：在一定的温度条件下，微生物数量十倍减少所需的时间。 热致死时间：是指在一定温度下杀死所有某一浓度微生物所需要的时间。,70,（2）高温对培养基成分的有害影响及其防止 有害影响,形成沉淀物（多肽类 磷酸盐 碳酸盐） 破坏营养、提高色泽 改变培养基的pH 降低培养基浓度,71,防止法 A采用特殊加热灭菌法 A1对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应将糖液与其他成分作分别灭菌，待灭菌后再予以合并。 A2含Ca2+或Fe3+的培养基应与磷酸盐成分作分别灭菌，灭菌后再混合，这样就不易形成磷酸盐的沉淀。 A3对含有易被高温破坏成分的培养基，应进行低压灭菌或间歇灭菌。 A4在大规模发酵工厂中，对培养基灭菌可采用连续加压蒸汽灭菌法。 B过滤除菌法 C其他方法,72,2、辐射灭菌 辐射灭菌是利用电磁辐射产生的电磁波杀死大多数物质上的微生物的一种有效方法。用于灭菌的电磁波有微波、紫外线、X射线和射线等，它们都能通过特定的方式控制微生物生长或杀死它们。,73,3、过滤作用 （1） 在两层滤板之间放入多层滤纸，灭菌后使用，主要用于发酵工业。 （2） 膜滤器：由醋酸纤维素或硝酸纤维素制成的比较坚韧的具有微孔（0.22-0.45um）的膜，灭菌后使用。 （3） 核孔滤器：是用核辐射处理的很薄的聚碳酸胶片（厚10 um）再经化学蚀刻而制成，主要用于科学研究。,74,4、高渗作用 通过提高环境的渗透压即降低w值，可以控制微生物的生长。 5、干燥 6、超声波 超声波处理微生物悬液可以达到消灭它们的目的。目前超声波处理技术广泛用于实验室研究中的破细胞和灭菌。,75,第五节 微生物的培养方法,一个良好的培养装置的基本条件是： 按微生物的生长规律进行科学的设计，能在提供丰富而均匀营养物质的基础上，保证微生物获得适宜的温度和良好的通气条件（厌氧菌例外），此外，还要为微生物提供一个适宜的物理化学条件和严防杂菌的污染等。,76,一、实验室培养方法 （一）固体培养法 1、好氧菌的固体培养 2、厌氧菌的固体培养 （1）高层琼脂柱： （2）厌氧培养皿： （3）亨盖特滚管技术,77,Brewer 皿,高层琼脂柱,亨盖特技术,78,（4）厌氧罐技术：,79,厌氧罐 anaerobic jar,80,（5）厌氧手套箱技术,厌氧罐技术、厌氧手套箱技术和亨盖特滚管技术已成为现代实验室中研究厌氧菌最有效的“三大件”技术,81,82,（二）液体培养法 1、好氧菌的液体培养 设法增加培养液与氧的接触面积或提高氧的分压来提高溶氧速率，具体措施如： 浅层液体静止培养； 将三角瓶内培养物放在摇床上做摇瓶培养；在深层液体底部通入加压空气，并用气体分布器使其形成分布均匀、密集的微小气泡； 对培养液进行机械搅拌，并在培养器的壁上设置阻挡装置，等等；,83,（1）试管液体培养 （2）三角瓶浅层液体培养 （3）摇瓶培养 （4）台式发酵罐,84,Different culture methods,Liquid Culture,Batch culture,Batch & Continuous culture,10 ml,20 ml- 1 L,1 L - 1000L,Fermentor,85,2、厌氧菌的液体培养 在实验室中对厌氧菌进行液体培养时，若放入上述厌氧罐或厌氧手套箱中培养，就不必提供额外的培养措施；若单独放在有氧环境下培养，则培养基中必须加入还原剂，并用深层培养或同时在液面上封一层石蜡油或凡士林石蜡油，则可进行厌氧菌的培养。,86,二、生产实践中培养微生物的装置 （一）固态培养法 1、好氧菌的曲法培养 在生产实践上，好氧菌的固体培养方法都是将接过种的固体基质薄薄地摊铺在容器表面，这样，既可使微生物获得充分的氧气，又可让微生物在生长过程中产生的热量及时释放，这就曲法培养的基本原理。,87,挂曲