课件：金黄色葡萄球菌检测方法.ppt

葡萄球菌属,金黄色葡萄球菌的检测方法,引起毒素型食物中毒 分为：金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 腐生性葡萄球菌,葡萄球菌属（Staphylococcus）,对于加工过的食品或食品加工设备而言，此菌或其肠毒素的存在通常作为卫生条件差的一种指标。,金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片,生物学特性 1、形态与染色特性 G+，无芽孢、无鞭毛、无荚膜、不运动 2、培养特性： 3、生化特性：MR阳性，VP弱阳性，靛基质阴性 4、抵抗力 具有较强的抵抗力，80 30min 5、抗原结构 蛋白抗原表面抗原，无特异性。 多糖抗原半抗原，有型特异性,2.2 葡萄球菌属（Staphylococcus）,一、金黄色葡萄球菌的生物学特性 1、形态与染色：(staphylococcus aureus) G+，无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜。 典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8 mm左右，显微镜下排列成葡萄串状。 附： 金黄色葡萄球菌的显微照片 金黄色葡萄球菌的染色照片 金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片 金黄色葡萄球菌的透射电镜照片,食品中金黄色葡萄球菌的检验,2、培养特性： 金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，加少量葡萄糖或血液生长更旺盛需氧或兼性厌氧，最适生长温度37，最适生长pH 7.4。 金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在7.515%NaCl肉汤中生长。,金黄色葡萄球菌 在甘露醇盐平板上的菌落,2.2.2 生物学特性 6、毒素和酶 肠毒素形成条件： 存放温度：在37内，温度越高，产毒时间越短； 存放地点：通风不良氧分压低易形成肠毒素； 食物种类：含蛋白质丰富，水分多，同时含 一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。,2.2 葡萄球菌属（Staphylococcus）,金黄色葡萄球菌的检验 GB 4789.10-2010 第一法 金黄色葡萄球菌的定性检测 第二法 金黄色葡萄球菌 Baird-Parker 平板计数 第三法 金黄色葡萄球菌MPN 计数,第一法金黄色葡萄球菌定性检验,国家标准检验方法GB4789.10-94,操作步骤： 1、样品的处理 2、增菌和分离培养 3、鉴定：染色镜检、血浆凝固酶试验 4、肠毒素的测定 5、结果报告,1、样品的处理 称取25g样品至盛有225mL7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000r/min10000r/min 均质1min2min，或放入盛有225mL7.5 %氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨 大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min2min。若样品为液态，吸取25mL样品至盛有225mL7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。,2、增菌和分离培养 1）将上述样品匀液于36 1 培养18 h24 h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。 2）将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker 平板和血平板。血平板36 1 培养18 h24 h。Baird-Parker 平板36 1 培养18 h24 h 或45 h48 h。,2、增菌和分离培养 3）金黄色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上，菌落直径为2 mm3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。,BP平板主要成分及作用：P223 氯化锂、甘氨酸 抑制非制病性葡萄球的生长 丙酮酸钠: 促进葡萄球菌生长 亚碲酸钾: 抑制G-杆菌生长，可被金黄色葡萄球菌还原为碲盐呈黑色 卵黄: 含蛋白质、卵磷、脂肪,金黄色葡萄球菌 在BP平板上的菌落形态 圆形，光滑突起，湿润，直径2-3mm，颜色呈灰色到黑玉色，边缘常为淡色（米黄色或灰白色略带灰色或黄色的白色），周围为一混浊带，在其外缘常有一透明圈。用接种针接触菌落似有黄油树胶的粘稠感,2、增菌和分离培养 3）长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。,血平板上金黄色葡萄球菌 菌落形态,金黄色葡萄球球菌的单个菌落在血平板上呈金黄色，有时也为白色，大而突出、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。,3、鉴定 1）染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为 0.5m1m。,2）血浆凝固酶试验： 挑取Baird-Parker 平板或血平板上可疑菌落1 个或以上，分别接种到5 mL BHI和营养琼脂小斜面，36 1 培养18 h24 h。 取新鲜配置兔血浆0.5 mL，放入小试管中，再加入BHI 培养物0.2 mL0.3 mL，振荡摇匀，置36 1 温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。,有无致病性的重要指标,2）血浆凝固酶试验： 同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。 结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5 mL BHI，36 1 培养18 h48 h，重复试验。,有无致病性的重要指标,阳性,4、葡萄球菌肠毒素的检验 可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定，应按附录B检测葡萄球菌 肠毒素。 5、结果与报告 1）结果判定：符合2（3）、3，可判定为金黄色葡萄球菌。 2）结果报告：在25 g（mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。,金黄色葡萄球菌肠毒素的检测 一、动物学试验 主要用幼猫和猴。 二、血清学试验 肠毒素作为抗原，可以和特异性抗体发生结合性反应，产生可见沉淀。 方法主要有： 免疫琼脂扩散法 反向间接血凝试验 免疫荧光法 酶联免疫吸附法,第二法 直接计数方法 1、样品的稀释 2、样品的接种 3、培养 4、典型菌落计数和确认 5、结果计算与报告,1、样品的稀释 同上 2、样品的接种 根据对样品污染状况的估计，选择2 个3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10 倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1 mL 样品匀液以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 接种量分别加入三块Baird-Parker 平板，然后用无菌L 棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25 50 的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。,3 培养 在通常情况下，涂布后，将平板静置10 min，如样液不易吸收，可将平板放在培养箱36 1 培养1 h；等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，36 1 培养，45 h48 h。,4 典型菌落计数和确认 1）金黄色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上，菌落直径为2 mm3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。,4 典型菌落计数和确认 2）选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀释度3 个平板所有菌落数合计在20 CFU200 CFU 之间的平板，计数典型菌落数。如果： a）只有一个稀释度平板的菌落数在20 CFU200 CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落； b） 最低稀释度平板的菌落数小于20 CFU 且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落； c） 某一稀释度平板的菌落数大于200 CFU 且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；,4 典型菌落计数和确认 2）如果： d） 某一稀释度平板的菌落数大于200 CFU 且有典型菌落，且下一稀释度平板上有典型菌落，但其平板上的菌落数不在20 CFU200 CFU 之间，应计数该稀释度平板上的典型菌落；以上按公式（1）计算。 e） 2 个连续稀释度的平板菌落数均在20 CFU200 CFU 之间，按公式（2）计算。 3 ) 从典型菌落中任选5 个菌落（小于5 个全选），分别做血浆凝固酶试验。,5 结果计算：,5 结果计算：,根据Baird-Parker平板上金黄色葡萄球菌的典型菌落数，按5中公式计算，报告每g（mL）样品中金 黄色葡萄球菌数，以CFU/g(mL)表示；如T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。,第三法 MPN计数方法 1、样品的稀释 2、接种培养 3、典型菌落确认 4、结果与报告,1、样品的稀释 同上 2、接种培养 1）根据对样品污染状况的估计，选择3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10 倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1 mL 样品匀液接种到10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤管，每个稀释度接种3管，将上述接种物于36 1 培养45 h48 h。 2）用接种环从有细菌生长的各管中，移取1环，分别接种Baird-Parker平板，36 1 培养45 h48 h。,3 典型菌落确认 1）同上。 2）从典型菌落中至少挑取1 个菌落接种到BHI肉汤和营养琼脂斜面，36 1 培养18 h24 h。 进行血浆凝固酶试验 4 结果与报告 计算血浆凝固酶试验阳性菌落对应的管数，查MPN 检索表（见附录C），报告每g(mL)样品中金黄色葡萄球菌的最可能数，以MPN/g（mL）表示。,后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用,主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 公司秉着以优质的服