多胺与葡萄芽休眠关系的探索-.doc

多胺与葡萄芽休眠关系的探索姓名：何爱华 学号：03235 导师：韦军教授扬州大学农学院植物学专业 江苏省扬州市大学南路88号 邮编：225009 摘要：多胺是一种具有内源活性的脂肪族含氮碱，广泛存在于生物体内，其代谢变化与高等植物的生长和发育关系密切，实验证明多胺参与了细胞分裂、胚胎发生、生根、开花、种子萌发、花粉管生长、果实形成及成熟等生理过程，但是多胺与落叶果树芽休眠的关系研究较少，本文主要是关于多胺与葡萄芽休眠关系的探索实验的初步设计。 多胺（polyamine ,PA）是生物体内代谢过程中产生的具有生物活性的低分子量脂肪族含氮碱。有二胺、三胺、四胺及其它胺类。多胺的发现至今已有300多年的历史，1926年搞清了多胺的结构，但是长期以来多胺被认为是无用的代谢产物或废物。自1965年Dykotra和Herbst首次发现再生肝中多胺参与细胞的分裂和生长过程后，多胺的研究才逐步深入。多胺广泛存在于高等植物、真菌及原核生物体中。在高等植物中多胺分布于根、茎、叶花、果实、种子、块茎、胚等部位，在植物个体生长发育中起多方面的作用。1、多胺的生理功能及其在果树生长发育中的作用与其他高等植物一样，果树中普遍存在多胺。有研究表明，苹果幼苗中存在腐胺（putrescine,Put）、亚精胺(spermidine,Spd)和精胺(spermine,Spm);有人从葡萄、伏令夏橙中也测出腐胺、亚精胺和精胺。1.1促进生长和细胞分化 多胺对植物生长有明显的促进作用。在许多系统中，当生长速度被促进时，多胺的浓度及其生物合成速度也增高了，这些增高总是先于或与DNA和蛋白质的增加同时发生。由图可见，苹果吸收根内精胺（Spm）含量在4月初至10月初有5次高峰。5-7月间高峰迭起，此期正值果树坐果、根系生长、花芽分化、果实生长。由图我们同样可以看出华盛顿脐橙果实内源多胺的含量变化和果实膨大基本保持一致。 华盛顿脐橙叶片内多胺的含量在12月到来年6月保持较高的水平，这期间也正是生长代谢较旺盛时期。 1.2.促进花粉管萌发和伸长Bagni在苹果花粉萌发研究中观察到，在花粉萌发的头15min（此时花粉管尚未伸出）腐胺、精胺、亚精胺合成速度达到高峰。 1.3.对坐果的影响Costa实验，叶面单独或混合施用腐胺、亚精胺和精胺，可以提高苹果坐果率。Roversi报道甜樱桃于花开35%时腐胺可提高坐果率，一般是对照的4.13倍。但是高浓度精胺不利于坐果。有实验表明，精胺浓度大于1mg/ml时，核桃花粉发芽受抑制。1.4.促进果树花芽形成和花的发育 Costa在苹果上施用高浓度的腐胺，增加了每新梢的花芽数。Edwards用腐胺、精胺、亚精胺通过叶柄施于红玉幼树，促进花芽形成的效果与氨态氮处理效果相近。1.5.多胺与果树的胁迫反应 多胺对各种胁迫条件反应十分敏感。当苹果、杏和葡萄叶片内K+浓度下降时，引起腐胺增加10-20倍。在水分胁迫条件下，植物组织中腐胺水平的提高可以起缓冲剂的作用颉颃细胞中PH值的变化，因此腐胺可以在一定程度上保护质膜和原生质体不受自发的或外界的伤害。另有实验表明，外源喷施多胺能有效提高柑橘抗寒性。1.6.多胺对果树的抗衰老作用 外源多胺具有延缓黑暗中离体叶片衰老的作用，以被很多实验证实（蒋琳等1993；Altman,1982;Kwon and Kim,1995）。同时由于多胺与乙烯拥有共同的合成前体SAM，多胺还具有延缓果实衰老，延长果实贮藏时间等功能。1.7.多胺与休眠的关系关于多胺与休眠的关系国内外研究报道的较少，韦军（1995）研究苹果花芽、叶芽休眠期多胺含量表明（如下图），前休眠期花芽、叶芽内均含有腐胺、戊二胺、己二胺、亚精胺、精胺，五种多胺，但是进入深休眠期花芽、叶芽内都只含有腐胺、亚精胺、精胺，三种多胺。进入休眠期戊二胺、己二胺的突然消失是否预示着这两种多胺与休眠存在着密切联系有待于进一步实验证实。2.落叶果树芽冬季休眠的研究在自然条件下，温带落叶果树为了适应冬季的低温，芽在外表上停止生长的现象，称为芽的休眠。经典植物学认为：木本植物的芽由生长状态进入休眠状态，随后又逐渐脱离休眠的过程，通常可分为三个阶段，即前休眠（predormancy）、真休眠（endodormancy）和被迫休眠（ecodormancy）,上述休眠的三个阶段实际上反映了芽的不同休眠状态或休眠深度，前人一般采用摘叶法来推测芽的休眠阶段，但该种方法只能了解植物芽休眠状态变化的结果，无法知道植物芽休眠状态发生变化的内部原因。因此，为了明确植物芽的休眠诱导和脱离休眠的生理机制，首先需要了解能够对植物芽休眠的诱导和脱休眠过程有直接影响的生理代谢产物，从而建立能够评价植物芽休眠深度的生理生化指标。因此，植物芽在休眠过程中，细胞内代谢产物的变化与芽休眠深度的关系研究一直是植物休眠生理研究上不断探讨的一个课题，近十多年来，国内外在该研究方向上，以木本果树为试验材料，相继获得了一系列有意义的实验结果：(1) 植物内源激素与芽休眠有密切关系，但这种关系随植物种类和激素种类的不同而不同。生长素（IAA）处理可使苹果叶芽和花芽对低温的需求量增加，脱落酸(ABA) 含量的增加能够使樱桃的休眠期延长，苹果、樱桃的芽在休眠时乙烯含量较高，萌芽时乙烯含量迅速下降，利用外源乙烯处理时，可促进苹果、樱桃的芽进入休眠（Saure,1985）。在苹果芽休眠的一定阶段，用细胞分裂素（TDZ）处理可有效打破休眠（Fuchicami 等1997）。Torrigiani和Scoccianti（1995）在控制赤霉素（GA）合成的基因发生突变而失去自身合成GA能力的某些植物中发现，只有在应用外源GA处理后，这些植物的芽才能脱休眠。(2) 休眠组织核苷酸的代谢与植物芽的休眠深度有密切关系，发现休眠芽不能将腺嘌呤核苷酸（ATP）转化为非腺嘌呤核苷酸（NTP）。因此，ATP与NTP的比值可指示植物休眠的深度，这一实验结果已在苹果等树种上得到证实（Champagant,1986）。(3) 芽休眠的不同阶段，芽内的多肽含量也不同，Seeley(1994)在桃、李、乌饭树等植物上发现，夏季末进入休眠的叶芽和花芽内多肽含量较低，随着气温逐渐降低，休眠芽内的多肽含量逐渐升高，芽萌发时多肽含量达到最高。(4) 蛋白质代谢亦与芽的休眠状态有关，Tamura等（2002）在日本梨芽休眠的温度调节研究中发现，随着供试材料对需冷量的要求不断得到满足，芽细胞内会不断合成新的蛋白质，称之为低温诱导蛋白（cold-induced proteins,缩写CIPs）。目前，在梨树叶芽和花芽中，已发现9种CIPSs，当对梨芽进行高温（45，4小时）脱休眠处理时，能在芽内发现与低温处理芽内相同的低温诱导蛋白（CIPs）。(5) 在桃等核果类果树的休眠芽组织细胞膜中，发现饱和脂肪酸和不饱和脂肪的比值随着芽休眠深度的变化而变化（Szalay和Pedryc，1990）。(6) 细胞组织的水分状态变化与芽的休眠深度的变化呈现明显的同步关系。短日照和低温条件可促进苹果和桃芽细胞组织内自由水逐渐转化为束缚水，随着芽休眠深度的增加，束缚水含量不断升高，当芽的自然休眠期结束后，束缚水开始转化为自由水（Faust和Erez，1997）。苹果休眠芽在一定阶段用细胞分裂素（TDZ）处理后，随着休眠的逐渐打破，可发现芽内自由水含量逐步上升（Bubanh和Faust，1995）。 上述研究结果揭示了在植物休眠器官内不同的代谢产物及变化与休眠深度的关系，为建立评价木本植物叶、花芽休眠深度的生理生化指标提供了有意义的探索，同时，也存在如下需要进一步讨论或研究的问题：（1）研究结果未能明确植物休眠器官内的代谢产物变化是导致休眠的原因，还是伴随休眠深度变化的结果，如ATP/NTP、饱和脂肪酸/不饱和脂肪酸、肽和CIPs等的变化,而明确这一点对探讨休眠状态变化的生理机制有重要作用；（2）许多研究结果认为：植物内源激素与植物的休眠有密切关系，但迄今为止，植物内源激素变化与休眠深度关系的研究结果主要反映的是游离态内源激素变化与芽休眠深度的关系，如樱桃休眠芽中的乙烯、苹果休眠芽中的ABA含量变化等，而实际上，在植物细胞内还存在着束缚态内源激素，其含量可能大于游离态激素，束缚态内源激素同样具有其特定生理功能，甚至某些内源激素只有与受体结合后，才能发挥其特定生理作用，如乙烯和脱落酸等（Champagnat和Come，1986），未能同步研究束缚态内源激素的变化与植物休眠深度变化的关系，可能会影响植物内源激素对休眠调节作用评价的可靠性，这可能也是目前国内外在该方向研究上，实验结果难以取得一致的主要原因之一（Fuchicami 和Wisniewski， 1997）；（3）上述研究中，评价了不同的代谢产物与芽休眠深度的关系，如苹果芽中的ATP/NTP、日本梨芽中的低温诱导蛋白（CIPs）和桃芽中的多肽等，但这些代谢产物影响休眠的生理生化基础尚不够充分，至今未见利用上述代谢产物作为生理生化指标，评价其它木本植物芽休眠深度的有关研究报道。 综上所述，国内外在植物休眠组织代谢产物与休眠深度关系的研究现状，正如国际著名植物休眠生理研究学者Seeley(1994)所指出：植物休眠的生理机制就象一只 “黑匣子”，迄今为止，人类对植物休眠机理的研究仅仅是描述了这个“黑匣子”的表面，远未真正打开了这只“黑匣子”。这需要我们开拓思路，另辟蹊径，寻找新的突破口。 3.多胺与葡萄芽休眠关系的探索试验设计 落叶果树的休眠是一个十分复杂的问题，前人已经在这方面作了大量的工作，随着近年来设施栽培面积的不断增大，休眠问题迫切需要解决。葡萄是主要的设施栽培落叶果树树种，因此本实验选取了葡萄为实验材料，旨在了解葡萄不同休眠深度与多胺含量的关系以及采用打破休眠药剂处理后多胺的变化。 3.1材料和方法 本实验以5年生葡萄树为材料，品种藤稔，砧木SO4和DE，于11月中旬开始每隔20天采取藤稔扦插苗、藤稔嫁接到砧木SO4和DE的嫁接苗以及SO4和DE的砧木苗的带芽枝条，分成两份，一部分为带芽枝条进行萌芽试验，一部分取下芽进行多胺及其他生理生化指标含量测定。 3.1.1需冷量的观察 每次取回的枝条选取芽饱满无病虫害，50个芽扦插到人工气候室进行萌芽实验，温度（昼/夜）23/15，光照2400-3000LX，昼/夜14/10h；空气湿度50%-70%，正常浇水管理，培养10天开始，每隔3天记录一次萌芽率，以60%萌芽为该材料满足需冷量。同时利用自动温湿度记录仪连续记录室外温湿度变化，借助犹他模型（Utoh model）等需冷量计算模式进行计算。 3.1.2 生理指标测定 取回带芽枝条后用消毒后手术刀及时取下芽，去除少量木质部称其鲜重，立刻放入超低温冰箱。 可溶性糖含量的测定采用蒽酮法，淀粉含量的测定采用高氯酸水解，然后用蒽酮法测定。多胺测定参照韦军（1993）及Smith(1991)方法稍作改进。 3.1.3打破休眠的研究 将取回的枝条同萌芽实验扦插到人工气候室，同时用5%氰氨（H2CN2）、5%石灰氮（CaCN2）和外源多胺进行涂芽处理。处理后5天取下芽，放入超低温冰箱进行多胺含量测定。 3.2小结 需冷量的观察是了解休眠深度的最直观的表现，但是需冷量受外界因素的影响较大，所以通过可溶性糖含量和淀粉含量的变化，以及与多胺的变化规律，以期望找到衡量休眠深度的较为理想的量化指标。通过打破休眠的处理，以及处理后多胺含量的变化以期望找到多胺与休眠的关系。本实验的创新之处在于，从多胺这个角度探索休眠的原因，同时国内外目前对多胺的研究主要集中在游离态多胺含量的测定，对于束缚态多胺的测定报道较少，不能完全解释多胺的含量和变化。实验尚处于准备和摸索阶段，难免有很多不足之处，希望通过植物学专题讨论，进一步完善，恳请大家批评指正。 参考文献：1.Phillip T Evans and Russell L Malmberg Do polyamines have roles