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五种芳香植物精油及精气对支气管炎病菌的抑菌效果研究 摘要：以金黄色葡萄球菌（Staphylocous aureus）、乙型溶血性链球菌（β-Hernolytic streptococcus）为试验菌，采用滤纸片法、二倍稀释法及皿内试验法，测定了5种芳香植物精油及精气的抑菌效果。结果表明，所有供试植物的精油及精气均具有一定的抗菌活性。在精油抑菌试验中，对金黄色葡萄球菌的抑菌活性由强到弱依次为艾叶（Artemisia argyi L薄荷（Mentha haplocalyx Briq）、迷迭香（Rosemarinus officinalis Linn）、香叶天竺葵（Pelargonium graveolens LHerit）、罗勒（Ocimum basilicum L）；对乙型链球菌的抑菌活性由强到弱依次为香叶天竺葵、罗勒、艾叶、薄荷、迷迭香。在精气抑菌试验中，5种植物1 g整叶对金黄色葡萄球菌的抑菌率为21.01%67.52%，除迷迭香外，另外4种植物的抑菌率均在30%以上；对乙型溶血性链球菌的抑菌率为14%78.89%，除艾叶、罗勒外，另外3种植物的抑菌率均在30%以上。 关键词：芳香植物；精油；精气；抑菌试验；支气管炎 中图分类号：TQ653；TQ460.7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）02-0354-05 DOI：10.14088/j.c; word-spacing: 0px; text-transform: none; color: rgb(51,51,51); text-align: left; font: 16px/28px 微软雅黑, Helvetica; letter-spacing: normal; text-indent: 0px; -webkit-text-stroke-width: 0px / 慢性支气管炎即支气管炎，指由于病毒和细菌的反复感染而形成的气管、支气管黏膜及其周围组织的慢性非特异性炎症，以连续性咳嗽、咯痰或伴有气喘及反复发作、经久不愈的慢性过程为其主要临床特征，发病不分年龄，不分季节。慢性支气管炎现已成为危害人类健康最严重的慢性病之一，其病情反复发作，经久不愈，常并发阻塞性肺气肿及肺心病等，严重影响人们生活质量和健康2，3。 支气管炎的主要的病因之一是细菌感染，且金黄色葡萄球菌（Staphylocous aureus）和乙型溶血性链球菌（β-Hemolytic streptococcus）是引起细菌性支气管炎的主要病菌之一4，5。目前临床治疗支气管炎使用的抗菌药物主要包括大环内酯类、β-内酰胺类、氟喹诺酮类三大类化学类。虽然对各种程度的细菌性支气管炎均具有一定的治疗效果，但化学类抗菌药物普遍存在易产生耐药性、药物副作用大、治疗费用高、易复发等缺点7，8。因此，疗效稳定、副作用小、性价比高的植物抗菌功能受到国内外研究者的重视。 植物精气是指植物新陈代谢过程中，植物的花、叶、木材、根、芽等的油腺组织不断分泌的一种浓香挥发性物质，而相对精气而言，植物精油则一般是指以芳香植物的花、根、茎、叶、枝、干、果实或分泌物为原料，经蒸馏、干馏、萃取、压榨、吸附或吸收等工艺提取的具有香气和香味的挥发性油状液体物质的总称9，10。研究表明，许多芳香植物兼有药用植物和天然香料植物双重属性。一直以来，其精油及精气一直被当作一种重要的植物种质资源，广泛应用于香精香料、杀菌、驱虫防腐、消毒、防病、治病等领域10-12。已有研究报道，精油及精气有消毒杀菌的作用13-17，并可预防和改善支气管炎13，17-22，但对其抑菌的效果尚缺乏深入的分析。本文采用滤纸片法、二倍稀释法及皿内试验法，对5种芳香植物精油及精气的抑菌效果进行比较研究，以便进一步明确芳香植物对于呼吸系统的调节保护作用，并将其应用于室内园艺疗法中。 1 材料与方法 1.1 材料 供试植物为香叶天竺葵（Pelargonium graveolens LHerit）、罗勒（Ocimum basilicum L）、艾叶（Artemisia argyi L迷迭香（Rosmarinus officinalis Linn）、薄荷（Mentha haplocalyx Briq），植物材料及植物精油均由广东韩山师范学院植物资源研究所提供。 供试菌种为金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌，均由汕头大学微生物实验室提供。 主要仪器有ZHWY-2102C双层恒温培养振荡器、SPX智能型生化培养箱、LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌锅、DGX-9243B-2烘干箱、VS-840净化工作台（佳滤牌）、XW-80A微型旋涡混合仪等。 LB固体培养基：蛋白胨5 g、酵母粉2.5 g、氯化钠5 g、琼脂粉7 g、去离子水500 mL，调节pH为7.07.2，121 灭菌30 min；LB液体培养基：蛋白胨5 g、酵母粉2.5 g、氯化钠5 g、去离子水500 mL，调节pH为7.07.2，121 灭菌30 min。 1.2 方法 1.2.1 供试菌的培养 使用移液枪分别吸取金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌20 μL，分别接种在装有10 mL LB液体培养基试管中，37 摇床中培养12 h，活化后置于4 冰箱中备用。 1.2.2 菌悬液制备 先用平板菌落计数法测定菌原液浓度23，24。以金黄色葡萄球菌为例，取8支试管依次编号，各加入9 mL去离子水，取1 mL金黄色葡萄球菌活化液置于1号试管中，旋窝混匀，从1号试管中吸取1 mL加入2号试管，再次混匀，相同步骤依次重复至8号试管。最后，于5、6、7、8四支试管中各取0.1 mL涂布于LB固体培养基平皿中，每管3个重复以上。然后均置于培养箱中37 培养10 h后进行观察。每个编号试管均挑选生长均匀且菌落数在20300个的3个培养皿进行计数，计算其平均值及菌原液浓度。然后使用稀释法将已知浓度菌液用无菌生理盐水稀释至1106 cfu/mL的菌悬液备用。 1.2.3 抑菌试验 1）滤纸片法测定抑菌作用：在超净工作台上将灭菌后的LB固体培养基倒入培养皿中，每皿1520 mL。待冷却凝固后，取菌原液0.1 mL于培养基中，涂布均匀，再将无菌滤纸片贴在含菌平板上，每皿呈三角形贴3片。再在每个滤纸片中间滴加10 μL精油，每种精油做3个平行重复。同时，设置一个无精油处理的空白对照。待精油被滤纸片充分吸收后，将培养皿翻转并放入37 生化培养箱中，24 h后观察结果。抑菌圈试验判定标准：抑菌圈直径大于20 mm，极敏；1520 mm，高敏；1015 mm，中敏；710 mm，低敏；小于7 mm，不敏感。2）最低抑菌浓度MIC的测定25，26采用二倍稀释法，以金黄色葡萄球菌为例。11支试管依次编号，除1号试管先加入2 mL用无水乙醇乳化的精油（无水乙醇与精油的体积比2：98，预试验结果已表明，该浓度乙醇对供试菌种均无明显抑制作用），其他210号试管分别先加入1 mL LB液体培养基，然后吸取乳化精油1 mL加入2号试管中轻轻吹打混匀，接着从2号试管中吸取1 mL混匀液，加入至3号试管中，再次混匀，依次加至10号试管，11号试管中加入1 mL去离子水作为阴性对照。最后各试管中分别加入0.5 mL LB液体培养基和0.5 mL菌液，使其终浓度依次为50.000、25.000、12.500、6.250、3.125、1.563、0.781、0.391、0.195、0.098 mg/mL，于37 摇床中培养24 h观察记录。MIC判定标准25，26：阳性管呈浑浊状，阴性管澄清，以不浑浊的最低精油浓度为该精油对该菌的MIC值。 3）最低杀菌浓度MBC的测定25，26：观察MIC结果，挑取各管培养液，于LB培养基上划线，以皿内有细菌生长的最小药液浓度作为该精油对该菌的MBC。 1.2.4 供试植物抑菌率测定 植物叶片的采集与处理：选择生长状况良好、无虫蛀点的供试植物，采其新鲜叶片，去掉叶柄后用去离子水冲洗23次，去除表面异物，标记并置于干净的培养皿中晾干，再将叶片放入体积分数为75%的乙醇中浸泡约15 s，平铺在超净工作台上紫外照射15 min，晾干待用。 抑菌试验：将配好的供试菌悬液取0.1 mL，接种到LB固体培养基上（先做平板，再加菌液）。用三角涂布器涂布均匀，待菌液被培养基吸收后，将培养皿倒置，在皿盖中分别加入供试植物的整叶1 g，设2个不加入任何叶片的培养皿为对照，每组试验重复3次（叶片不与琼脂接触）。最后将培养皿放入37 培养箱内培养10 h，然后观察平板培养基上细菌的生长情况及菌落大小，并计算菌落个数，与空白对照进行对比观察，计算抑菌率，评定抑菌效果。 抑菌率=（对照菌落数-处理菌落数）/对照菌落数100% 2 结果与分析 2.1 供试精油抑菌圈测定 由表1可知，供试的5种精油对金黄色葡萄球菌的抑菌效果由强到弱依次为艾叶精油、薄荷精油、迷迭香精油、香叶天竺葵精油、罗勒精油，其中除了艾叶精油和薄荷精油的抑菌效果属于高敏之外，其他3种精油的抑菌效果均属于中敏；供试的5种精油对乙型溶血性链球菌的抑菌效果由强到弱依次为香叶天竺葵、罗勒、薄荷、艾叶、迷迭香，其中除了香叶天竺葵精油对乙型溶血性链球菌的抑菌效果属于高敏外，其他4种精油对供试菌的抑菌效果都属于中敏。 2.2 供试精油的最小抑菌浓度（MIC）及最小杀菌浓度（MBC） 从表2可知，供试的5种精油对金黄色葡萄球菌的抑菌效果由强到弱依次为艾叶精油、薄荷精油、迷迭香精油、香叶天竺葵精油、罗勒精油，其中抑菌效果最好的是艾叶精油和薄荷精油，MIC分别为0.781、6.250 mg/mL，MBC分别大于12.5、25.0 mg/mL。迷迭香精油、香叶天竺葵精油、罗勒精油的抑菌效果较弱，MIC均为12.5 mg/mL，而MBC均大于25.0 mg/mL；供试5种精油对乙型溶血性链球菌的抑菌效果由强到弱依次为香叶天竺葵、罗勒、艾叶、薄荷、迷迭香，其中抑菌效果最好的是香叶天竺葵精油和罗勒精油，MIC分别为3.125、6.250 mg/mL，MBC分别大于6.25、25.00 mg/mL，其他3种精油的抑菌效果较弱。 2.3 供试植物对金黄色葡萄球菌的抑制作用 由表3可知，5种供试植物1 g整叶对金黄色葡萄球菌均有抑制作用，抑菌率由高到低依次为罗勒、薄荷、艾叶、香叶天竺葵、迷迭香，其中罗勒的抑菌率最高，达67.52%，其他4种植物的抑菌率均在20%以上。 2.4 供试植物对乙型溶血性链球菌的抑制作用 由表4可知，5种供试植物1 g整叶对乙型溶血性链球菌均有抑制作用，抑菌能力由高到低依次为薄荷、迷迭香、香叶天竺葵、罗勒、艾叶，其中薄荷的抑菌率最高，达到78.89%，香叶天竺葵、迷迭香的抑菌率均达到70%以上，罗勒和艾叶的抑菌能力较弱，抑菌率均在20%以下。 3 小结与讨论 研究表明，植物在长期进化过程中会分泌一些挥发性物质抑制或杀灭细菌、真菌等微生物，对自身起到保护作用29，30。而植物精油作为植物提取物，通常具有多种活性，抑菌作用是其重要的方面31-34。 本试验结果表明，5种芳香植物精油及精气对2种供试细菌均具有不同程度的抑菌作用。其中，对金黄色葡萄球菌的抑菌活性由强到弱依次为艾叶、薄荷、迷迭香、香叶天竺葵、罗勒；对乙型链球菌的抑菌活性由强到弱依次为香叶天竺葵、罗勒、薄荷、艾叶、迷迭香；而在精气抑菌试验中，5种植物1 g整叶对金黄色葡萄球菌的抑菌率为21.01%67.52%，除迷迭香外，另外4种植物的抑菌率均在30%以上；对乙型溶血性链球菌的抑菌率为14.00%78.89%，除艾叶、罗勒外，另外3种植物的抑菌率均在30%以上。以上结果表明芳香植物用于改善细菌性支气管炎病症具有一定的可行性。 另有文献报道，植物所拥有的多种生理功效与植物精气或精油有关10，35。已知植物精气和精油是两类不同的物质，在化学组成及组分相对含量上均存在一定差异，从化学角度来说，二者具有不同的特性。因此需要分别从精气和精油的角度，对芳香植物的抑菌功效进行综合评价。 本试验5种芳香植物精油及精气成分分析表明，精油及精气其主要成分都是一些萜烯类物质，此外还有一些醛、酮、酯、酸等18，37-40，43-44。如罗勒精油主要成分为β-芳樟醇、薄荷精油主要成分为薄荷醇（单萜烯类）、艾叶精油主要成分为左旋龙脑（单萜烯类）、香叶天竺葵精油主要成分为香茅醇（单萜烯类）、迷迭香精油主要成分为香叶醇（单萜烯类）等均具有广谱的抑菌效果。因而精油抑菌试验中发现艾叶精油和香叶天竺葵精油对供试菌的抑菌效果比较好，可能与其含有丰富的左旋龙脑和香茅醇有关41，42。 这5种芳香植物中，除了香叶天竺葵精气成分分析还未见报道外，其他4种植物的主要精气成分均是一些萜烯类物质。如罗勒精气主要成分为蒿脑、薄荷精气主要成分为香芹酮（单萜烯类）、艾叶精气主要成分为石竹烯（倍半萜烯类）、迷迭香精气主要成分为樟脑（单萜烯类）等也均具有广谱的抑菌效果。因此精气抑菌试验中发现罗勒和薄荷的抑菌效果较为显著，可能与其含有丰富的蒿脑和d-柠檬烯有关41，43。 由此可见，芳香植物精油及精气的抑菌功效，与其成分组成密切相关。本试验主要是对芳香植物精油及精气的抑菌功效进行初步探索。但是，其抑菌成分的有效作用浓度及造成不同芳香植物抑菌功效存在差别的原因，还有待进一步研究。本试验采用常规抑菌试验方法，对5种芳香植物的精油及精气的抑菌功效进行综合评价。同时也为抗菌类的天然药物开发提供理论依据，进一步提升芳香植物在园艺疗法中的应用价值。 参考文献： 万桂芹.沙参麦冬汤加减治疗慢性支气管炎56例临床观察J.中国全科医学，2010，13（16）：1813. 孙 婧.慢性支气管炎治疗现状分析J.辽宁中医药大学学报，2010，12（6）：278-279. 金亚明.中医药治疗慢性支气管炎研究进展J.辽宁中医药大学学报，2009，11（5）：224-226. 邓 琪，梁 粤，郭丽冰，等.三丫苦对乙型溶血性链球菌的体外抗菌作用J.中国实验方剂学杂志，2010，16（7）：123-124. 凌 巍.食品源病原菌金黄色葡萄球菌的分布及其肠毒素基因的研究D.河北保定：河北农业大学，2007. 蔡 绚，于小红，程 竹.莫西沙星治疗慢性支气管炎细菌感染急性发作的临床疗效观察J.中国医药学杂志，2008，28（3）：221-222. 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