斑替枝孢生物学特性及致病性初步研究.docx

斑替枝孢生物学特性及致病性初步研究 斑替枝孢生物学特性及致病性初步研究 加州鲈鱼（Micropterus salmonides）原名大口黑鲈，分类学上属鲈形目（Perciformes），太阳鱼科，身体长而侧扁，稍纺锤形，横截面为椭圆形。全身覆盖银白色或淡黄色细密鳞片，但脊柱颜色较深，通常呈绿青色或淡黑色，同时沿侧线附近常有黑色斑纹。腹部呈灰白色。背肉稍厚，墨绿色，体侧青绿。生活在淡水湖泊，原产自美洲，1983年引进中国进行养殖，通过人工驯化后，性格较温和，不喜欢跳跃，容易受到惊吓。加州鲈鱼通常可以在1%以下的咸淡水域中正常生长，水质要求每升水溶氧量在1.5 mg以上，比鲈鱼、鳜鱼耐低氧能力强。鲈鱼肉是高蛋白食物，维生素A和维生素B丰富，滋补肝肾，健脾和胃，而且对感冒止咳有很好的功效，能化痰止咳，含有丰富的微量元素钙、镁、锌、硒等。加州鲈鱼生长迅速，肉质鲜美，容易养殖，且经济效益高，是中国常见的淡水养殖品种。草鱼（Ctenopharyngodon idellus）属鲤形目鲤科，是中国重要的淡水养殖鱼类，它和鲢、鳙、青鱼一起，构成了中国著名的四大家鱼。 本研究所用菌株是从患病加州鲈鱼体表分离，通过分子鉴定和形态鉴定，初步鉴定为斑替枝孢（Cladosporium bantianum），属真菌门（Fung）半知菌亚门（Deuter omycota）丝孢纲（Hyphomycetes）丛梗孢目（Miniliales）暗色孢科（Dematiaceae）枝孢属（Cladosporium）。能引起皮肤暗色丝孢霉病，尤其侵染脑部引起脑囊肿或脓肿，少数为脑膜炎。在PDA和PCA培养基上生长迅本文由收集整理速，菌落扁平。鼠灰色绒毛状，中央高凸，呈纽扣状，表面有不规则皱褶，37 生长良好。在Sabourand培养基上，菌落稍大，灰棕色绒毛状，背面黑色。菌丝灰棕色，分生孢子椭圆形、梨形、链生。 为研究斑替枝孢的生物学特性和对其他淡水鱼类的致病性，本试验通过不同pH和不同温度条件对该真菌的生长状况和菌落大小的影响，研究该真菌的生物学特性。同时将该真菌回复感染草鱼和鲤鱼，观察真菌对草鱼和鲤鱼是否具有致病性，为淡水鱼类的中草药防治提供一定的理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料 该菌株分离自患病加州鲈鱼体表溃烂处，在PDA培养基上纯培养，将获得的纯培养菌株保存于5 冰箱备用。菌株的分离与鉴定见魏福伦等的报道。 1.2 方法 1.2.1 不同pH对斑替枝孢的影响 将该真菌接种在pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的PDA培养基上，在25 下恒温培养，观察真菌菌株的生长状况，每隔24 h观察一次，采用十字交叉法测定真菌菌落直径并记录下来。每个梯度做3个平板，试验周期为15 d。 1.2.2 不同温度对斑替枝孢的影响 将该真菌接种在PDA培养基上，在温度为5、10、15、20、25、30、35、40 下培养，观察真菌菌株的生长状况，测量其直径记录下来。每个梯度做3个平板，测量方法同上。试验周期为14 d。 1.2.3 斑替枝孢的致病性 用于回复感染的淡水鱼是草鱼和鲤鱼，取自乌江网箱。取回后置自然条件下培养，待鱼在自然环境中生长状况稳定后进行回复感染。每组10尾鱼装到养鱼箱中，每次试验3箱鱼，一箱为对照组，另两箱为试验组。对照组将真菌菌株接种在鱼胸鳍下，放进鱼箱中培养。试验组一箱鱼直接刮入真菌菌株进行培养，另一箱鱼在鱼胸鳍下接种真菌菌株。每24 h观察一次，观察该菌对淡水鱼是否具有致病性。记录每天的观察结果，试验周期为20 d。 1.2.4 数据分析 用SPSS_Statistics-v19.0win32软件进行差异性计算，用SPSS软件的单样本t检验计算t值及Sig.（双侧）值。将Sig.（双侧）值与p值进行比较，p值表示概率，得出差异性是否显著。 2 结果与分析 2.1 不同pH对斑替枝孢的影响 由表1、图1可知，斑替枝孢在pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的条件下均能生长。由表1可知，t值各不相同，但Sig.（双侧）值均为0.000，小于显著水平0.05，与t检验的零假设相符，即不同pH之间菌落生长速率存在显著差异（接种菌饼均为2 mm）。pH 9.0时，真菌生长速度最快，菌落直径达52.3 mm，菌落最为致密，pH 7.0、8.0时，真菌生长速度也相对较快，菌落直径分别达51.3、52.0 mm，因此最适生长的pH为9.0。 2.2 不同温度对斑替枝孢的影响 真菌的生长状况在不同温度下有明显的差异，在温度低于5 和高于35 时，均不能生长（接种菌直径为2 mm）。在1030 范围内，该菌的生长速度随温度的升高而增快，在20 时生长速度相对较快，菌落直径达61.7 mm，菌落最为致密。25 时，真菌生长速度也相对较快，菌落大小为58.7 mm，但菌落不如20 时致密。因此20 为斑替枝孢的最适生长温度。用SPSS软件计算t值和Sig.（双侧）值，t值各不相同，Sig.（双侧）值均小于显著水平0.05，与t检验的零假设不相符，存在显著性差异（表2、图2）。 2.3 斑替枝孢的致病性 将真菌菌株接种于草鱼和鲤鱼，培养后观察，发现此菌株对草鱼和鲤鱼的生长没有明显的影响，没有引起淡水鱼患病或死亡。在鱼体的伤口周围取材进行再培养，没有发现埃里格孢，初步判断斑替枝孢不感染草鱼和鲤鱼，单一菌株的斑替枝孢可能对淡水鱼无致病性。 3 小结与讨论 斑替枝孢是枝孢属真菌，属半知菌亚门，菌丝体淡褐色至褐色，有时产生子座。斑替枝孢又叫毛样枝孢霉、枝孢样枝孢霉，为腐生真菌，广泛存在于自然界的土壤、某些动物的粪便、蔬菜、腐木、鸟巢、腐烂水果中，而从鱼类体表溃烂伤口分离该菌株则属首次。 为了对斑替枝孢引起的病害进行有效防治，对从患病加州鲈鱼体上分离的该菌进行生物学特性的研究。研究结果表明，该菌株在PDA培养基上pH为5.011.0时均能生长，以pH 9.0时生长最快，菌落最为致密，直径达52.3 mm，为该真菌最适生长pH。该真菌在不同温度下有明显的差异，在温度低于5 和高于35 时，均不能生长。在20 时该菌生长较快，菌落直径达61.7 mm，菌落最为致密，为斑替枝孢的最适生长温度。表明该菌对于温度、pH等条件适应范围广，要求不严格