奶粉中金黄色葡萄球菌的检测.docx

奶粉中金黄色葡萄球菌的检测 一、【实验步骤】1.样品的采集和送检 采取10包小型包装的奶粉，注意要采取整件包装及包装的完整性。2.检样处理 用75%酒精棉球擦拭消毒袋口后，手戴消毒手套，以无菌刀打开袋口，无菌杓对10个包装进行取样，注意每取一个样品时更换新的无 菌刀，杓。在铺有等大无菌硫酸纸的精度为0.1g的分析天平上分别秤取10个样品各25g并放入10个装有玻璃珠的三角烧瓶内，每秤取一个新样品时更换新 的无菌硫酸纸，用记号笔在烧瓶底部分别编号为110，用1个200ml的灭菌量筒和1个50ml灭菌的量筒分别量取200ml和25ml已用电炉温热的 灭菌生理盐水共225ml徐徐加入1号三角烧瓶内（先加少许使奶粉调成糊状，再全部加入，以免奶粉结块），振摇均匀，使充分溶解后即为1：10稀释液。 210号烧瓶操作与1号相同。 小结：这一过程需要的仪器试剂有75%酒精棉球一包，消毒手套一双，无菌刀十个，无菌杓十个，无菌硫酸 纸20张，精度0.1g的分析天平一台，300ml装有玻璃珠的三角烧瓶十个，记号笔一支，200ml灭菌量筒一个，50ml灭菌量筒一个，灭菌生理盐水 10L，1L大烧杯2个。3.增菌培养 用电炉将7.5%NaCl肉汤培养基加热至融化，取10个直径9cm的无菌平皿用记号笔在平皿底部分别编号为110，用一个 50ml的灭菌量筒量取45ml融化的培养基倒入1号平皿中，用一支5ml的无菌吸管吸取一号烧瓶中的稀释液5ml加入1号平皿中，210号样品按同法 制成相应的210号平皿，注意每吸取一个样品需要更换一支新的5ml灭菌吸管。将这十个平皿置于37温箱培养24h。看到样品在肉汤中呈浑浊生长。 小结：这一过程需要的仪器试剂有电炉一台，37温箱一台，直径9cm的无菌平皿10个，记号笔一支，50ml的灭菌量筒量一个，5ml的无菌吸管十支，锥形瓶一个，2L烧杯一个。4.分离培养 用一支用酒精灯火焰充分消毒并凉至室温的接种针取一个平皿的增菌培养物划线接种至血平板和Baird-Parker平板（注意接种下一个平皿中的增菌培养物时要用酒精灯火焰消毒接种针）在平板底部用记号笔标记其所来自样本的编号，将其置于37温 箱培养24h取可疑菌落（金黄色葡萄球菌在血平板上菌落为金黄色，有时也为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。在Baird- Parker平板上的菌落较小，圆形、光滑突起、湿润，直径23mm，灰黑到黑色，边缘为淡色，周围为一圈浑浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌 落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无浑浊带和透明圈）作革兰染色镜检，金葡菌为革兰阳性球菌，葡萄状排列，无芽孢，无荚膜，根据 此特性，将可疑菌落同法接种于琼脂斜面及普通肉汤中，分别相应标记为110号，37培养24h，作进一步鉴定。 小结：这一过程需要的仪器试剂有酒精灯一个，火柴一盒，接种针一支，37温箱一台，血平板和Baird-Parker平板各十个，显微镜一台，琼脂斜面及普通肉汤管各10个,1L烧杯2个。5.血浆凝固酶试验 （1）玻片法：取干净玻片一块，用记号笔将玻片划成两格，背面标记为1，用两支吸管分别滴加新鲜兔血浆及生理盐水各一滴，用两支 用酒精灯火焰充分消毒并凉至室温的接种针挑取步骤4中1号琼脂斜面的待检菌落分别于血浆和生理盐水混合，立即观察结果，同法处理其余九个样品。每挑取一次 待检菌后均需要对接种针在酒精灯火焰上消毒并凉至室温。如血浆中有明显颗粒出现，而生理盐水中无自凝现象即为阳性。 小结：这一过程需要的仪器试剂有干净玻片十块，记号笔一支，新鲜兔血浆15ml，生理盐水100ml，100ml、200ml烧杯各一个，酒精灯一个，接种针一个。 （2）试管法:用一支10ml的吸管吸取新鲜兔血浆10ml置于一个100ml的烧杯中，用一个50ml的量筒量取40ml生理 盐水倒入盛有新鲜兔血浆的烧杯中，轻振混匀，此即1：4血浆，用一支1ml的吸管吸取0.5ml混合液放入标记为1号的小试管中，再用一支1ml的吸管吸 取培养24h的1号待检菌株肉汤培养物0.5ml，同法处理其余九个样品，编号，将十个试管轻振混匀后放入37温箱中，同法处理其余九个个样品，试管外壁相应编号为110。每半小时观察一次，观察6h同时分别在已知阴性和阳性葡萄球菌肉汤培养物及肉汤培养基中加入1：4血浆0.5ml，分别标记为a、b、c，作为对照，分别用记号笔按下表编号为14（表1）表一 金黄色葡萄球菌血浆凝固酶试验（试管法）试管血浆（1：4）细菌培养液肉汤a0.5ml已知阳性菌0.5ml_b0.5ml已知阴性菌0.5ml_c0.5ml_ _0.5ml1100.5ml待检菌0.5ml_通常在34h出现血浆凝固。观察时将试管倾斜或倒置，如呈现凝块者被认为是阳性。多数情况下玻片法与试管法二者结果平行，符合率通常在90%。偶有玻片法阴性而试管法阳性，此时应用试管法证实。 小结：这一过程需要的仪器试剂有10ml吸管一支，50ml量筒一个，100ml烧杯一个，生理盐水100ml，100ml烧杯两个，1ml吸管十一支，小试管十三个，试管架一个，37温箱一台，记号笔一支。6.肠毒素测定 液体透析培养法：用一个100ml的无菌量筒量取60ml产毒培养基装入一个宽2.5cm、长80cm的透析袋中，两端用棉线扎紧，将透析袋放入250ml三角烧瓶内，用一个50ml量筒量取15ml灭菌生理盐水加入三角烧瓶内，透析袋两端留在瓶口，用棉塞塞好，121高压灭菌30min。用一支5ml吸管吸取5ml生理盐水置于步骤4中已培养24小时的待测菌琼脂斜面培养物上洗下菌落，倾入上述培养瓶中，每个菌种一瓶，共十瓶标记为110号，37振 荡培养48h，振速为100r/min。用十支灭菌吸管吸出菌液于十个灭菌离心管中，对应标记为110，800r/min离心30min，用十支灭菌滴 管吸取上清液做双向琼脂扩散，在抗血清和提取物之间有明显沉淀线为阳性，如为阴性，再装入透析袋内，用电风扇吹，再做琼脂扩散。 小结：这一过程需要的仪器试剂有产毒培养基1L，500ml,2L灭菌烧杯各一个，100ml、50ml灭菌量筒各一个，宽2.5cm、长80cm的透析袋十个，棉线2m，剪刀一把，250ml三角烧瓶十个，生理盐水300ml，高压灭菌锅一台，5ml灭菌吸管一支，37温箱一台，离心机一台，灭菌离心管十个，灭菌滴管十支，记号笔一支。【实验步骤中所需仪器试剂】 仪器设备：精度0.1g的分析天平一台，电炉一台，37温 箱一台，显微镜一台，高压灭菌锅一台，离心机一台，300ml装有玻璃珠的三角烧瓶十个，250ml灭菌三角烧瓶十个，200ml灭菌量筒一 个，100ml灭菌量筒一个，50ml灭菌量筒四个，2L灭菌烧杯三个，1L灭菌烧杯四个，500ml灭菌烧杯一个，200ml灭菌烧杯一个，100ml 灭菌烧杯四个，10ml灭菌吸管一支，5ml的无菌吸管十一支，1ml灭菌吸管十一支，灭菌离心管十个，灭菌滴管十支，灭菌小试管十三个，锥形瓶一个，酒 精灯一个，火柴一盒，接种针一支，试管架一个。材料：75%酒精棉球一包，消毒手套一双，无菌刀十个，无菌杓十个，无菌硫酸纸20张，记号笔一支，灭菌生理盐水10L，新鲜兔血浆15ml，产毒培养基 1L，直径9cm的无菌平皿10个，血平板和Baird-Parker平板各十个，琼脂斜面及普通肉汤管各10个,干净玻片十块，宽2.5cm、长 80cm的透析袋十个，棉线2m，剪刀一把。二、【培养基配制】1.Baird-Parker培养基(PH7.5)制法：用两个50ml量筒分别量取30%卵黄盐水50ml和除菌过滤的1%亚硫酸钾溶液10ml加入到一个100ml的锥形瓶内，加盖在冰箱中保存。在一 个2L的烧杯中加入950ml蒸馏水，用精度0.1g的分析天平分别秤取胰蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母膏1.0g，丙酮酸钠10.0g，甘氨 酸12g，氯化锂(含6个结晶水)5.0g，琼脂20.0g，注意药品用不锈钢药杓取，每更换一个药品需更换一个新的药杓。药品称好后均加入到此2L烧杯 中，用玻璃棒搅拌，置于电炉上加热煮沸至完全溶解。冷却至25，用滴管吸取氢氧化钠溶液及稀盐酸来调节培养基的PH，与精密PH试纸对比至PH为7.5。用一个100ml量筒量取95ml，分装入十个100ml的锥形瓶中，每瓶95ml，121（103.4kPa）高压灭菌15min。临用时加热融化琼脂，冷至50，用一支5ml的吸管吸取预热至50的卵黄亚硫酸钾增菌剂5ml十次，在每个锥形瓶中均加入该增菌剂5ml，摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在并向储存不得超过48h。 小结：这一过程需要的仪器试剂有高压灭菌锅一台，精度0.1g的分析天平一台，冰箱一台，电炉一台，不 锈钢药杓八个，等大硫酸纸二十张，玻璃棒一个，精密PH试纸五条，直径9cm的无菌平皿十个，50ml量筒两个，100ml量筒一个，30%卵黄盐水 50ml，除菌过滤的1%亚硫酸钾溶液10ml，100ml的锥形瓶十一个，2L烧杯一个，500ml烧杯两个，滴管两个，5ml吸管一支，蒸馏水1L， 氢氧化钠溶液及稀盐酸各200ml，胰蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母膏1.0g，丙酮酸钠10.0g，甘氨酸12g，氯化锂(含6个结晶 水)5.0g，琼脂20.0g。2.7.5%氯化钠肉汤（PH7.4）制法：在一个2L的烧杯中加入1L蒸馏水待用，用精度为0.1g的分析天平分别秤取蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠75.0g加入到刚才的2L 烧杯中，注意药品用不锈钢药杓取，每更换一个药品需更换一个新的药杓。用玻璃棒搅拌，用电炉加热煮沸至完全溶解，冷至25，与Baird-Parker培养基同法校正PH值至7.4，分装入十个试管，121（103.4kPa）高压灭菌15min，待用。 小结：这一过程需要的仪器试剂有高压灭菌锅一台，精度0.1g的分析天平一台，电炉一台，不锈钢药杓三 个，等大硫酸纸十张，玻璃棒一个，精密PH试纸五条，大试管十个，2L烧杯一个，500ml烧杯两个，滴管两个，蒸馏水1L，氢氧化钠溶液及稀盐酸各 200ml，蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠75.0g。【制备培养基中所需仪器试剂】仪器设备：这一过程需要的仪器试剂有高压灭菌锅一台，精度0.1g的分析天平一台，冰箱一台，电炉一台，玻璃棒一个，100ml量筒一个，50ml量筒两个，2L烧杯两个，500ml烧杯两个，100ml的锥形瓶十一个，滴管两个，5ml吸管一支，大试管十个。 材料：不锈钢药杓十一个，等大硫酸纸三十张，精密PH试纸五条，直径9cm的无菌平皿十个，30%卵黄 盐水50ml，除菌过滤的1%亚硫酸钾溶液10ml，蒸馏水2L，氢氧化钠溶液及稀盐酸各200ml，胰蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母膏 1.0g，丙酮酸钠10.0g，甘氨酸12g，氯化锂(含6个结晶水)5.0g，琼脂20.0g。氢氧化钠溶液及稀盐酸各200ml，蛋白胨10.0g， 牛肉膏3.0g，氯化钠75.0g。 三、【仪器设备和试剂】设备：精度0.1g的分析天平一台，电炉一台，37温箱一台，冰箱一台，显微镜一台，高压灭菌锅一台，离心机一台。 仪器：300ml装有玻璃珠的三角烧瓶十个，250ml灭菌三角烧瓶十个，200ml灭菌量筒一 个，100ml灭菌量筒两个，50ml灭菌量筒六个，2L灭菌烧杯五个，1L灭菌烧杯四个，500ml灭菌烧杯三个，200ml灭菌烧杯一个，100ml 灭菌烧杯四个，10ml灭菌吸管一支，5ml的无菌吸管十二支，1ml灭菌吸管十一支，灭菌离心管十个，灭菌滴管十支，灭菌小试管十三个，100ml锥形 瓶十二个，酒精灯一个，试管架一个，玻璃棒一个，滴管两个，大试管十个。 试剂：灭菌生理盐水10L，新鲜兔血浆15ml，产毒培养基1L，30%卵黄盐水50ml，除菌过滤的 1%亚硫酸钾溶液10ml，蒸馏水2L，氢氧化钠溶液及稀盐酸各200ml，胰蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母膏1.0g，丙酮酸钠10.0g， 甘氨酸12g，氯化锂(含6个结晶水)5.0g，琼脂20.0g。氢氧化钠溶液及稀盐酸各200ml，蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠 75.0g。 材料：直径9cm的无菌平皿10个，血平板和Baird-Parker平板各十个，琼脂斜面及普通肉汤管各10个,直径9cm的无菌平皿十个，其它：火柴一盒，记号笔一支，宽2.5cm、长80cm的透析袋十个，棉线2m，剪刀一把，不锈钢药杓十一个，等大硫酸纸三十张，精密PH试纸五条，接种针一支，75%酒精棉球一包，消毒手套一双，无菌刀十个，无菌杓十个，干净玻片十块。四、【实验计划】 第一天：订购实验所需试剂，准备好火柴，记号笔，透析袋，棉线，见到，不锈钢药杓，精密PH试纸条，消毒手套。将实验所需仪器中要求是无菌的在高压灭菌锅中121（103.4kPa）高压灭菌15min，待用。 第二天：制备7.5%氯化钠肉汤（PH7.4）培养基待用，采集十份奶粉样品制备成1：10稀释液，进