[理学]微生物学实验讲义.doc

微生物学类实验讲义(适用专业：生物工程、生物技术、生物科学)北方民族大学生物科学与工程学院 2010年制定实验目录微生物学实验规则和安全3实验一 微生物学实验基本知识与准备5实验二 显微镜油镜的使用与细菌染色10实验三 细菌芽孢、荚膜的染色及其认识17实验四 显微镜测微技术及细菌运动性观察19实验五酵母菌个体、群体形态观察，血球板显微镜计数技术22实验六 放线菌个体、群体形态观察24实验七 霉菌个体、群体形态观察25实验八 培养基的配制及湿热灭菌，玻璃器皿的干热灭菌27实验九 微生物的分离与纯化31实验十 理化因素对微生物生长的影响，生长谱法测定微生物营养要求33微生物学实验规则和安全普通微生物学实验课的目的是：训练学生掌握微生物学最基本的操作技能，了解微生物学的基本知识，加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验，培养学生观察、思考、提出问题、分析问题和解决问题的能力，实事求是、严肃认真的科学态度以及敢于创新的开拓精神；树立勤俭节约、爱护公物的良好作风。微生物学实验室是一个严肃的实验场所，虽然普通微生物学实验所用的微生物材料一般为非致病菌或条件致病菌，但许多微生物是否具有致病性不是绝对的，与其数量、条件、感染途径等有关，所以在实验操作中，必须将所有的微生物培养物都看成是具有潜在致病性的。为了上好微生物学实验课，并保证安全，特制定如下规则和安全措施：1每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。2在整个实验过程中必须穿上实验服，留长发者，必须将长发挽在背后。实验台上除了记录本和笔(记录笔和记号笔)以外，不准堆放任何个人物品。3认真及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。4实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。5实验时小心仔细，全部操作应严格按照操作规程进行，禁止用嘴吸取菌液或试剂，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤等意外情况发生时，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐瞒。6实验过程中，切勿使乙醇(酒精)乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火器。7使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。显微镜的目镜在使用前后必须用浸有乙醇(酒精)的透镜纸擦净。对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放回原处，严禁将药匙交叉使用。8每次实验完毕后，必须把所用仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石炭酸液覆盖半小时后擦去，如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具(如吸管、玻璃刮棒等)在洗涤前须浸泡在3%来苏尔液中进行消毒。9每次实验需进行培养的材料，应标明自己的组别及处理方法，放于教师指定的地点进行培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。10每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告表格中，力求简明准确，认真回答思考题，并及时汇交教师批阅。11离开实验室前将手洗净，注意关闭门窗、灯、火、煤气等。 2009年9月1日实验一 微生物学实验基本知识与准备一、目的要求1了解微生物学实验基本概念，认识微生物学实验基本材料。2熟悉微生物实验所需各种常用器皿的名称和规格。3学会正确的清洗玻璃器皿的方法和包扎方法，为实验做准备。 4熟读与牢记微生物学实验规则和安全。二、实验原理为了保证实验顺利进行，要求把实验所用器皿清洗干净，保持灭菌后无菌状态，需要对培养皿、吸管等进行妥善包扎，试管和三角瓶要做棉塞。清洗方法根据实验目的、器皿的种类、所盛放的物品、洗净剂的类别和沾污程度等的不同而有所不同，不同的器皿包扎方法也不同。三、实验器材1常用的各种玻璃器皿(三角瓶、移液管、试管、吸管、培养皿、玻片)。2洗涤工具和去污粉、肥皂、洗涤液。3接种工具、棉花、纱布、棉线等。四、操作步骤(一) 玻璃器皿的认识1试管：微生物实验室所用的玻璃试管，根据其大小和用途不同，有下列三种型号：(1) 大试管(约18mm180mm)：可装倒平板用的培养基，也可作制备斜面用(需要大量菌体时用)和装液体培养基用于微生物的振荡培养。(2) 中试管(1315)mm(100150)mm ：装液体培养基培养细菌或做斜面用，也可用于细菌、霉菌、病毒等的稀释和血清学试验。(3) 小试管(1012)mm100mm：一般用于糖发酵或血清学试验，和其它需要节省材料的试验。2德汉氏小管观察细菌在糖发酵培养基内是否产气时，在小试管内倒置一小套管(约6mm36mm)(图1)，此小套管即德汉氏小管，又称发酵小倒管。3小塑料离心管 如图2所示，有1.5 mL和0.5 mL二种型号，主要用于小量菌体的离心、DNA(或RNA)分子的检测、提取等。图1. 德汉氏小管 图2. 小塑料离心管4玻璃吸管 微生物学实验室通常使用1mL、2mL、5mL、10mL的刻度玻璃吸管。有时需要使用不计量的毛细吸管(又称滴管)来吸取动物的体液、离心上清液以及滴加少量抗原、抗体等。5培养皿 又称平皿，由一底一盖组成一套，常用的培养皿皿底直径90mm，高15mm，皿底均为玻璃制成，需要使培养基表面干燥时，可使用陶器皿盖来吸收水分。在培养皿内倒入适量固体培养基制成平板，可用于分离、纯化、鉴定菌种、活菌计数以及测定抗生素、噬菌体的效价等。 6三角瓶与烧杯 三角瓶有100 mL、250 mL、500 mL和1000 mL等不同的规格，常用来装无菌水、培养基和振荡培养微生物等。常用的烧杯有50 mL、100 mL、250 mL、500 mL和1000 mL等，用来配制培养基与各种溶液等。7载玻片与盖玻片 普通载玻片大小为75 mm25 mm，用于微生物涂片、染色、形态观察等。盖玻片为18 mm18 mm。如果在较厚的玻片中央制一圆形的凹窝，就形成了凹玻片。可做悬滴观察活细菌以及微室培养用。8滴瓶用来装各种染色液、生理盐水等。9接种工具常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种锄、玻璃涂棒等。玻璃涂布棒：用涂布法在琼脂平板上分离单个菌落时需使用玻璃涂布棒。它是将玻璃棒弯曲或将玻璃棒一端烧红后压扁制成的。(二) 玻璃器皿的洗涤根据实验目的、器皿的种类、所装的物品、洗涤剂的种类和沾污程度等的不同，洗涤方法也有所不同。1洗涤液的配制 (1) 浓配方：重铬酸钾(工业用)50 g，浓H2SO4(工业用)1000 mL。配法：1000 mL工业用浓H2SO4在文火上加热，然后加人50 g重铬酸钾溶解即成。 (2) 稀配方：重铬酸钾(工业用)50 g，自来水850 mL，浓H2SO4(工业用)100 mL。 配法：将重铬酸钾溶解在自来水中，慢慢加人浓硫酸，边加边搅拌，配好后，贮存于广口玻璃瓶内，盖紧塞子备用。应用此液时，器皿必须干燥，同时切忌把大量还原物质带入。洗涤液可应用多次，直至溶液变为绿色时，才算失效。2新购置玻璃器皿的洗涤新购置的玻璃器皿一般含较多游离碱，应在2%的盐酸或洗涤液内先浸泡数小时，浸泡后用自来水冲洗干净。洗净后的试管倒置于试管筐内，三角瓶倒置于洗涤架上，培养皿的皿底和皿盖分开，依次压着皿边排列倒扣在桌上。晾干或在7080干燥箱内烘干备用。3使用过的玻璃器皿的洗涤方法(1) 试管、培养皿、三角瓶、烧杯的洗涤。可用瓶刷或海绵沾上肥皂或洗衣粉或去污粉等洗涤剂刷洗，然后用自来水冲洗干净。洗涤后，若内壁的水均匀分布成一薄层，表示油垢完全洗净，若还挂有水珠，则需用洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水冲洗。含有凡士林或石蜡等的玻璃器皿，必须先除去油污，可在5%苏打液内煮2次，再用热的肥皂水洗刷。装有固体培养基的器皿应先将其刮去，然后洗涤。带菌的器皿在洗涤前先浸在2%煤酚皂溶液或0.25%新洁尔灭消毒液内24 h或煮沸0.5 h，再用上法洗涤。带致病菌的培养物应先高压灭菌，然后倒去培养物，再进行洗涤。洗衣粉和去污粉较难冲洗干净而常在器壁上附有一层微小粒子，故要用水多次充分冲洗，或可用稀盐酸摇洗1次，再用水冲洗。若需精确配制化学药品，或做科研用的精确实验，要求自来水冲洗干净后，再用蒸馏水淋洗3次，烘干备用。(2) 玻璃吸管的洗涤 吸过菌液的吸管(滴管的橡皮头应先拔去)应立即投入2%煤酚皂溶液或0.25%新洁尔灭消毒液内，浸泡24h后方可取出冲洗。吸过血液、血清、糖溶液或染料溶液的吸管应立即投入自来水中，免得干燥后难以冲洗干净。待实验完毕，再集中冲洗。若吸管顶部塞有棉花，则冲洗前先将吸管尖端与装在水龙头上的橡皮管连接，用水将棉花冲出，然后再装人吸管自动洗涤器内冲洗，没有吸管自动洗涤器的实验室可用冲出棉花的方法多冲洗片刻。必要时再用蒸馏水淋洗。吸管的内壁如果有油垢，同样应先在洗涤液内浸泡数小时，然后再冲洗。洗净后，搪瓷盘中晾干或100 烘箱内烘干。(3) 载玻片的洗涤 玻片上如滴有香柏油，要先用纸擦去或浸在二甲苯内摇晃几次以溶解油垢，再在肥皂水中煮沸510 min，用软布擦拭后，立即用自来水冲洗，然后在稀洗涤液中浸泡0.52 h，自来水冲去洗涤液，最后用蒸馏水淋洗数次，待干后浸于95%乙醇中保存备用，使用时在火焰上烧去乙醇。 检查过活菌的玻片应先在2%煤酚皂溶液或0.25%新洁尔灭溶液中浸泡24 h，然后按上述洗涤，保存。(三) 玻璃器皿的包扎 1培养皿的包扎 培养皿常用牛皮纸或旧报纸包紧，一般以58套培养皿包成1包。包好后干热或湿热灭菌。或者不用纸包扎，直接放人特制的金属(不锈钢或铁皮)筒内，(图3)，加盖干热灭菌。图3 装培养皿的金属筒1.内部框架 2.带盖外筒2吸管的包扎 在干燥吸管的上端约0.5 cm处，塞入一小段11.5 cm长的棉花(勿用脱脂棉)，目的是避免将外界或嘴中杂菌吹入管内，或不慎将菌液吸出管外。棉花松紧要合适，若过紧，吹吸液体太费力，过松，吹气时棉花则会下滑。挑取45 cm宽的长纸条，将吸管尖端斜放在纸条的一端，与纸约呈30角，折叠纸条包住尖端， 左手握住吸管身，右手将吸管压紧，在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎。上端多余的纸条打一小结(图4)。包好的多支吸管可再用一张大报纸包成一捆灭菌。图4 单支吸管的包扎方法 干热灭菌时，吸管可不用报纸包扎，直接放入不锈钢筒内，只需尖端朝筒底。 3试管和三角瓶的包扎 试管塞上棉花塞，三角瓶塞上棉花塞(图5)或“通气式”纱布塞(用8层纱布代替棉花制成的塞子)，目的是提供通气条件和防止杂菌污染，外用牛皮纸或2层旧报纸与细线扎好。试管可以多支扎成一捆灭菌。图5 棉塞的做法五、思考题能否用橡皮塞、木塞来代替棉塞，为什么?实验二 显微镜油镜的使用与细菌染色虽然各种类型的显微镜能够观察到微生物的各种形态结构，但一般实验室常用的是普通光学显微镜。由于细菌体积小且透明，在活体细胞内又含有大量的水分，因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背景没有显著的明暗差，难于看清它们的形状，更谈不上识别其细微结构。而经过染色，就可借助颜色的反衬作用比较清楚地看到菌体形态，亦即菌体表面及内部结构着色与背景形成鲜明对比，这样便可在普通光学显微镜下清晰地观察到微生物的形状和结构，而且还可以通过不同的染色反应来鉴别微生物的类型和区分死、活细菌等，因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。本实验通过对细菌的染色观察，使同学们在掌握细菌染色技术的基础上，了解各种其它的染色制片技术；观察微生物的各种形态结构，以巩固课堂知识，增强感性认识。一、目的要求1掌握普通光学显微镜油浸系的原理。2使用油镜观察几种细菌的基本形态。3学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色和革兰氏染色方法及无菌操作技术。二、实验原理(一) 油镜物镜的基本原理微生物学研究用的显微镜的物镜通常有低倍物镜(16 mm，10)高倍物镜(4 mm，40-45)和油镜(1.8 mm，95-100)三种。油镜通常标有黑圈或红圈，也有的以“OI(oil immer-sion)字样表示，它是三者中放大倍数最大的。根据使用不同放大倍数的目镜，可使被检物体放大1000-2000多倍。从图1中可看出油镜的焦距和工作距离(标本在焦点上看得最清晰时，物镜与样品之间的距离)最短，光圈则开得最大，因此，在使用油镜观察时，镜头离标本十分近，需特别小心。使用时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n=1.52，与玻璃相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系，当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样就减低了视野的照明度 (图1)。图1 油浸系的原理利用油镜不但能增加照明度，更主要的是能增加数值孔径，因为显微镜的放大效能是由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度(称为镜口角)的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积，可用下列公式表示：NAnsin式中 NA=数值孔径；n=介质折射率；=最大入射角的半数，即镜口角的半数。因此，光线投射到物镜的角度愈大，显微镜的效能就愈大，该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。同时，的理论限度为90，sin90=1，故以空气为介质时(n=1)，数值孔径不能超过1，如以香柏油为介质时，则n增大，其数值孔径也随之增大。如光线入射角为120，其半数的正弦为sin60=0.87，则：以空气为介质时：NA=10.87=0.87以水为介质时：NA=1.330.87=1.15以香柏油为介质时：NA=1.520.87=1.32显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。它与物镜的数值孔径成正比，与光波长度成反比。因此，物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，则显微镜的分辨力愈大，被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出来。因此，一个高的分辨力意味着一个小的可分辨距离，这两个因素是成反比关系的，通常有人把分辨力说成是多少微米或纳米，这实际上是把分辨力和最小分辨距离混淆起来了。显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表示的。能辨别两点之间的最小距离（式中=光波波长）我们肉眼所能感受的光波平均长度为0.55 m，假如数值孔径为0.65的高倍物镜，它能辨别两点之间的距离为0.42 m。而在0.42 m以下的两点之间的距离就分辨不出，即使用倍数更大的目镜，使显微镜的总放大率增加，也仍然分辨不出。只有改用数值孔径更大的物镜，增加其分辨力才行。例如用数值孔径为1.25的油镜时，能辨别两点之间的最小距离为：因此，我们可以看出，假如采用放大率为40倍的高倍物镜(NA=0.65)，和放大率为24倍的目镜，虽然总放大率为960倍，但其分辨的最小距离只有0.42m。假如采用放大率为90倍的油镜(NA=1.25)，和放大率为9倍的目镜，虽然总的放大率为810倍，但却能分辨出0.22m间的距离。(二) 简单染色法所谓简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。例如，美蓝(亚甲蓝)实际上是氯化亚甲蓝盐，它可被电离成正、负离子；带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫(crystal violet)碱性复红(basicfu-chsin)番红(又称沙黄，safranine)等。细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。(三) 革兰氏染色法革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经复红复染后就成红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料(basic dye)初染液；媒染剂(mordant)；脱色剂(decolorising agent)和复染液(counterstain)。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystal violet)。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘(iodine)是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95的酒精(ethanol)。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是复红。三、实验器材1活材料：培养24h的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。2染色液和试剂：结晶紫、碘液、95%酒精、石炭酸复红 、蒸馏水、乙醚-乙醇混合液、香柏油。3器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。四、操作步骤(一) 油镜的使用1观察前的准备(1) 显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实验桌上。(2) 将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约10 cm左右，右侧可放记录本或绘图纸。(3) 调节光照：不带光源的显微镜，可利用灯光或自然光通过反光镜来调节光照，光线较强的天然光源宜用平面镜；光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，但不能用直射阳光，直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛。将10物镜转入光孔，将聚光器上的虹彩光圈打开到最大位置，用左眼观察目镜中视野的亮度，转动反光镜，使视野的光照达到最明亮最均匀为止。自带光源的显微镜，可通过调节电流旋钮来调节光照强弱。凡检查染色标本时，光线应强；检查未染色标本时，光线不宜太强。可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器、旋转反光镜调节光线。2低倍镜观察镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大，易于发现目标和确定检查的位置。将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢下降载物台，直至物像出现，再用细调节旋钮使物像清晰为止。用推动器移动标本片，找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。3 高倍镜观察在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜，低倍、高倍镜头是同焦的，在转换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察，调节光照，使亮度适中，缓慢调节粗调节旋钮，慢慢下降载物台直至物像出现，再用细调节旋钮调至物像清晰为止，找到需观察的部位，并移至视野中央进行观察，并准备用油镜观察。4油镜观察(1) 用粗调节器将镜筒提起约2cm，将油镜转至正下方。(2) 在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。(3) 从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中，其镜头几乎与标本相接，应特别注意不能压在标本上，更不可用力过猛，否则不仅压碎玻片，也会损坏镜头。(4) 从接目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野出现物像为止，然后用细调节器校正焦距。如油镜已离开油面而仍未见物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物像看清为止。5观察完后复原下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚乙醇混合液擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭2-3下即可，(注意向一个方向擦拭)。将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置，再将载物台下降至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，最后用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。(二) 细菌的简单染色1涂片：取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴蒸馏水，按无菌操作法取大肠杆菌涂片，调匀并涂成薄膜，注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀，做成浓菌液，注意取菌不要太多。2晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。3固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定(以不烫手为宜)，使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。但不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁坏。4染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1-2 min。5水洗：用水洗去涂片上的染色液，直至冲下之水无色时为止。6干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。7镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。(三) 细菌的革兰氏染色1涂片。2晾干。3固定，与简单染色法相同。4结晶紫染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量(以盖满细菌涂面)的结晶紫染色液染色1min；水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。5媒染：碘液，媒染1min；水洗：用水洗去碘液。6脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20-25s至流出液无色，立即水洗。7复染：滴加复红复染3-5min；水洗：用水洗去涂片上的复红染色液。8晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。9镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。10实验完毕后的处理：(1) 将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净：A先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。B用擦镜纸沾少许乙醚-乙醇混合液将镜头擦2-3次。C再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。将显微镜小心轻拿，按号放入显微镜柜中。(2) 观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，放入回收容器内。五、注意事项1不准擅自拆卸显微镜的任何部件，以免损坏。2镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。3观察标本时，必须依次用低、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。4革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。5染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。6选用幼龄的细菌。G+菌培养12 h-16 h，E.coli培养24 h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。六、实验结果绘出葡萄球菌和大肠杆菌的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。七、思考题1油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？2使用油镜时，为什么必须用香柏油？3镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？4作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？5革兰氏染色成败的关键一步是什么？实验三 细菌芽孢、荚膜的染色及其认识一、目的要求1学习掌握芽孢染色法。2学习掌握荚膜染色方法。3初步了解芽孢、荚膜的形态特征。二、实验原理(一) 芽孢染色法 利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区分。芽孢壁厚，透性低、着色、脱色均较困难，因此，当先用一弱碱性染料，如孔雀绿或碱性品红在加热条件下进行染色时，染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料经水洗脱，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液(如番红)处理，则菌体和芽孢易于区别。 (二) 荚膜染色法荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质。由于荚膜与染料的亲和力弱，不容易着色；而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去，所以通常用衬托染色法(负染色法)染色，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，从而在菌体周围形成一透明圈。由于荚膜富含水分，制片时应自然干燥，不可以加热固定，避免加热蒸发，影响观察。三、实验器材1活材料：培养3-5天的芽胞杆菌，荚膜菌。2染色液和试剂 ：1%结晶紫水溶液、20%CuSO4水溶液、孔雀绿染液，番红水溶液。3器材： 载玻片、擦镜纸、显微镜等。四、操作步骤(一) 芽孢染色法1取芽孢杆菌涂片、干燥、固定。2在涂片上滴加质量浓度5%孔雀绿水溶液，然后把片子放在火焰上方加热，在加热的过程中，勿使染料干掉，需不断向涂片上添加孔雀绿溶液。使载玻片上出现蒸汽约十min，取下载玻片使之冷却，水洗。3用番红染色液复染1min，水洗。4吸干，镜检，芽孢呈绿色，细胞呈红色。 (二) 荚膜染色1涂片。2自然干燥固定。3结晶紫染色2min。4硫酸铜水溶液冲洗脱色，吸水纸吸干残液。5镜检，菌体染成深紫色，菌体周围的荚膜呈淡紫色。五、实验结果1绘图表示你观察到的两种芽孢杆菌的芽孢在形状、大小、着生位置上有什么不同？2绘图表示你观察到的荚膜菌的形态，图示颜色。六、思考题1芽孢染色时，如一时疏忽玻片上的染液被烘干，此时能否立即添加染液？为什么？2若涂片上观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么原因？实验四 显微测微技术及细菌运动性观察一、目的要求1了解测微尺的构造和使用，学会测量微生物细胞大小的方法。2学习悬滴法观察细菌运动性技术二、实验原理(一) 显微测微技术微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。其大小的测量需在显微镜下用目镜测微尺来进行，但由于测量的是放大后的图像，故目镜测微尺在不同放大倍率下每格实际代表的长度也随之变化，因此，需用物镜测微尺来校正在不同放大倍率下目镜测微尺每格所代表的实际长度。 物镜测微尺是中央刻有精确刻度的载玻片，一般是将1 mm等分为100格，每格长0.01 mm，即10 pm，它不直接用于测量细胞大小，而是用于校正目镜测微尺的每格的相对长度。目镜测微尺是一个可放人接目镜的直径均为1.75 mm的圆形玻片，其中央有精确的等分刻度(有50格和100格两种)测量时，需将其放人接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。(二) 细菌运动性在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛。通常使用压滴法或悬滴法观察细菌的运动性。观察时，要适当减弱光线，增加反差，如果光线很强，细菌和周围的液体就难以辨别。 三、实验器材1活材料：培养12-16h的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母2试剂：香柏油、二甲苯、凡士林等。3器材：目镜测微尺，物镜测微尺、凹载玻片、盖玻片、镊子、接种环、滴管、擦镜纸、显微镜。四、操作步骤() 显微测微技术1装目镜测微尺： 取出接目镜，把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺刻度朝下放在目镜镜筒内的隔板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插人镜筒内。2校正目镜测微尺 (1) 将物镜测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上 (2) 先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺刻度与物镜测微尺的刻度平行。利用移动器移动物镜测微尺，使两尺的第一条刻度线相重合，再向右寻找另外两条重合的刻度线，分别数出两重合线之间物镜测微尺和目镜测微尺所占的格数，由下列公式算出目镜测微尺每格所代表的长度。目镜测微尺每格长度( 两测微尺重合线间镜台测微尺格数10) / 两测微尺重合线间目镜测微尺格数用同样的方法换成高倍镜进行校正，记录并计算在每种倍率下目镜测微尺每一格所代表的长度。(3) 酵母细胞大小的测定 目镜测微尺校正完毕后，取下镜台测微尺，换上酵母水浸片，在不同倍率下测量菌体的长度和宽度，记录测定值，并计算出酵母的长、宽值。(5-10个取平均)(二) 悬滴法观察细菌运动性1在洁净盖玻片周围涂少许凡士林。2在盖玻片中央滴一小滴菌液，或用接种环取1-2环菌液置于中央。3将凹玻片反转，使凹窝中心对准盖玻片上的菌液滴，液滴不得与凹玻片接触，以接种环柄轻压使盖玻片与凹玻片粘在一起，液滴处于封闭的小室中，防止液滴干燥和气流的影响。4小心将凹玻片翻转过来，使菌滴仍悬浮在盖玻片下和凹窝中心。5先用低倍镜找到悬滴边缘，再用高倍镜观察。观察时光线要调得暗一些。用悬滴法分别观察大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的运动性。细菌的运动有一定的前进方向，并可转弯，极生单鞭毛菌类多为直线运动，周生鞭毛菌类多作波浪式运动。五、注意事项1检查细菌运动的载玻片和盖玻片都要洁净无油，否则将影响细菌的运动2制水封片时菌液不可加得太多，过多的菌液会在盖玻片下流动，因而在视野内只见大量的细菌朝一个方向运动，从而影响了对细菌正常运动的观察。六、实验结果 1报告测微计算过程与结果。2描述各菌运动方式。 七、思考题1为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？2在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小，测定结果是否相同？为什么？实验五 酵母菌个体、群体形态观察，血球板显微镜计数技术一、目的要求1学会使用显微镜观察酵母菌形态的方法。2观察并掌握酵母菌的菌落特征、个体形态、生长及繁殖方式。3学会区别死活菌的方法。4了解血球计数板计数的原理，学会测定酵母细胞总数方法。二、实验原理用血球计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。血球计数板是一块特制的厚载玻片，其上由四条槽构成三个平台，中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小格(即1625)，另一种是一个大方格分成25个中方格，每个中方格又分为16个小方格(即2516)，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个，每一个大方格边长为1 mm，则每一个大方格的面积为1 mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1 mm3。计数时，如果使用1625的计数板，要按对角线方位取左上、左下、右上、右下上述4个中格进行计数(即计数100个小格中的酵母细胞数)，如果使用2516规格的计数板，则除了计数上述4个中格外，还要计数中央的1个中格，即计数80个小格中的酵母细胞数，分别按下述公式计算出酵母细胞数。 (1) 1625格的血球计数板计算公式：1 mL酵母细胞数=A/416104稀释倍数 (2) 2516格的血球计数板计算公式：1mL 酵母细胞数= A/525104稀释倍数 三、实验器材 啤酒酵母菌悬液，显微镜，血球计数板，载玻片，盖玻片，接种环，吕氏美蓝染液。四、操作步骤(一) 血球板计数1菌悬液的制备：为便于计数，对样品进行适当稀释，稀释程度以每小格内含510个酵母为宜，可采用10倍系列稀释法。2加菌悬液样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，用吸水纸吸去多余水液。3显微镜计数：加样后静止5min，然后将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数，计数时，对位于线上酵母菌，可采取只记数两条边的办法，当酵母菌芽体达到母细胞大小的二分之一时，可记作两个细胞。4计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用电吹风吹干。(二) 死活菌鉴别1在干净载玻片中央加一滴吕氏美蓝染色液，以无菌操作用接种环挑取少量酵母菌体放于美蓝液中，混合均匀。2取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下(以免产生气泡)，使其盖在菌液上，将多余菌液用吸水纸吸干。3将载片置于载物台上，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。4染色约0.5 h后再进行观察，注意死细胞数量是否增加。五、实验结果1结果绘图说明你所观察到的酵母形态特征。2报告计数结果。六、思考题根据你的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差？力求准确？实验六 放线菌个体、群体形态观察一、目的要求1学习并掌握放线菌形态的显微镜观察方法。2观察放线菌的菌落特征、个体形态及其孢子的形态。二、实验原理放线菌一般由分枝状菌丝组成，它的菌丝可分为基内菌丝(营养菌丝)、气生菌丝或孢子丝三种。放线菌生长到一定阶段，大部分气生菌丝分化成孢子丝，通过横割分列的方式产生成串的分生孢子。孢子丝形态多样，有直、波曲、钩状、螺旋状、轮生等多种形态。孢子也有球形、椭圆形、杆状和瓜子状等等。它们的形态构造都是放线菌分类鉴定的重要依据。 放线菌的菌落早期绒状同细菌菌落月牙状相似，后期形成孢子菌落呈粉状、干燥，有各种颜色呈同心圆放射状。三、实验材料1菌种。2培养基。 3器皿：培养皿，载玻片、盖玻片、无菌滴管、镊子、接种环、小刀(或刀片)水浴锅，显微镜，超净工作台，恒温培养箱。 四、操作步骤(一) 插片培养法1取融化并保温在50的高氏1号培养基15-20ml，倒入9厘米的无菌皿中，冷凝成平板。2用接种环取放线菌孢子于无菌水中，制成孢子悬液。3用无菌吸管吸孢子悬液1滴于平板上，用无菌刮铲涂抹均匀。4取无菌盖玻片，倾斜的插入培养基中，每皿插入5-8片。5将平板倒置在28-30 温箱中，培养3-4 d。6取插片一张，用擦片纸擦去玻片一面的放线菌，微热固定。7在盖玻片上，滴加石炭酸复红染色1 min，水洗风干。8镜检。取干净载玻片一张，将染色的盖玻片面向下放在载玻片上。在油镜下观察放线菌的菌丝(包括基内菌丝和气生菌丝)、孢子丝(有直形、波状菜、螺旋状等)和孢子形态。(二) 印片法1制备菌悬液和平板培养基同(一)。2取菌悬液一环，在平板培养基上划线6-7次，置于28-30 的温箱中培养3 d。3取生长好的放线菌的培养皿，用接种针将菌苔和培养基切割成小方块，并用针穿过培养基挑起。4取一张干净载玻片，通过灯焰稍微加热，然后用针将菌苔表面轻轻地在玻片的不同部位压几次，在压菌苔时应避免和玻片摩擦搅乱印痕，影响观察。5将印片在灯焰上加热固定，用石炭酸复红染色1min，水洗，风干。6镜检。先用低倍镜观察，找到印痕，更换高倍镜观察，再用油镜观察放线菌的菌丝体、孢子丝及孢子的形态，并绘图。五、实验结果绘图描述放线菌形态六、思考题镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？实验七 霉菌个体、群体形态观察一、目的要求 掌握观察霉菌形态的基本方法，并观察其形态特征。 二、实验原理 霉菌可产生复杂分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体(尤其是繁殖菌丝)及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多(约为3-10m)，常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。观察霉菌的形态有多种方法，常用的有下列三种：直接制片观察法： 是将培养物置于乳酸石炭酸棉蓝染色液中，制成霉菌制片镜检。此染色液制成的霉菌标本片其特点是：(a)细胞不变形；(b)具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间；(c)溶液本身呈蓝色，有一定染色效果。载玻片培养观察法：此法是接种霉菌孢子于载玻片上的适宜培养基上，培养后用显微镜观察。这种方法可观察霉菌自然生长状态下的形态。玻璃纸培养观察法：为了得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态还可利用玻璃纸透析培养法进行观察。此法是利用玻璃纸的半透膜特性及透光性，将霉菌生长在覆盖于琼脂培养基表面的玻璃纸上，然后将长菌的玻璃纸剪取一小片，贴放在载玻片上用显微镜观察。三、实验器材 曲霉（Aspergillus sp.），青霉（Penicillium sp.），根霉（Rhizopus sp.），乳酸石炭酸棉蓝染色液，查氏培养基平板，无菌吸管，载玻片，盖玻片，解剖针，镊子，滤纸等。 四、操作步骤 （一）一般观察法 于洁净载玻片上，滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落的边缘处取小量带有孢子的菌丝置染色液中，再细心地将菌丝挑散开，然后小心地盖上盖玻片，注意不要产生气泡。置显微镜下先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜。 （二）载玻片观察法 1将略小于培养皿底内径的滤纸放入皿内，再放上U形玻棒，其上放一洁净的载玻片，然后将二个盖玻片分别斜立在载玻片的两端，盖上皿盖，把数套（根据需要而定）如此装置的培养皿叠起，包扎好，用1.05 kg/cm2，121.3 灭菌20min或干热灭菌，备用。 2将6-7 ml灭菌的马铃薯葡萄糖培养基倒入直径为9cm的灭菌平皿中，待凝固后，用无菌解剖刀切成0.5-1 cm2的琼脂块，用刀尖铲起琼脂块放在已灭菌的培养皿内的载玻片上，每片上放置2块。 3用灭菌的尖细接种针或装有柄的缝衣针，取（肉眼方能看见的）一点霉菌孢子，轻轻点在琼脂块的边缘上，用无菌镊子夹着立在载玻片旁的盖玻片盖在琼脂块上，再盖上皿盖。 4在培养皿的滤纸上，加无菌的20甘油数毫升，至滤纸湿润即可停加。将培养皿置28培养一定时间后，取出载玻片置显微镜下观察。 五、实验结果 绘图说明你所观察到的霉菌形态特征。 六、思考题 比较四种霉菌形态上的异同。实验八 培养基的配制及湿热灭菌；玻璃器皿的干热灭菌一、目的要求1明确培养基配制的原理，掌握制备培养的基本技术。2学习并掌握微生物实验室常用的两种灭菌方法湿热灭菌法和干热灭菌法。二、实验原理人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的混合营养基质称为培养基。培养基含有微生物所需的6大营养要素(水分、碳源、氮源、能源、矿质元素和生长素)和适宜的pH、渗透压及氧化还原电位等。设计和制作培养基是研究微生物生命活动规律和利用微生物进行工业发酵生产必须的重要基础工作。培养基成分与配比合适与否，对微生物生长发育、物质代谢、发酵产物积累和生产工艺都有很大影响。良好的培养基能充分发挥菌种的生物合成能力，以达到最佳的生产效果；相反，若培养基成分、配比或原料不合适，菌种的生长繁殖及发酵效果就差。不同微生物的营养要求虽具有一定共性，但也存在许多差别。只有根据微生物的营养理论，结合研究对象的特殊营养要求、代谢特点及培养目的，才能设计或选择出适宜的培养基。