课件：基因工程3大肠杆菌表达系统.ppt

前言,基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。 基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物即实现基因的高效表达。 基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。,第三章 真核基因在大肠杆菌中的表达,最佳的基因表达体系： 目的基因的表达产量高; 表达产物稳定; 生物活性高; 表达产物容易分离纯化。,第一节基因的表达系统与表达策略,宿主细胞的选择,适合目的基因表达的宿主细胞的要求: 1、容易获得较高浓度的细胞； 2、能利用易得廉价原料； 3、不致病、不产生内毒素； 4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态； 5、容易进行代谢调控； 6、容易进行DNA重组技术操作； 7、产物的产量、产率高， 8、产物容易提取纯化。,宿主细胞分为两大类： 1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、 链霉菌等； 2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。,一、真核基因的大肠杆菌表达体系,目前，已被用于表达外源蛋白质的表达系统有细菌（大肠杆菌和枯草杆菌）、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞等。但比较而言，大肠杆菌表达系统具有明显的优越性。,大肠杆菌表达体系的优越性： 1. 对大肠杆菌的背景知识（完成基因组全测序哦），特别是基因表达调控的分子机理有（乳糖操纵子）深刻的了解； 2. 是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体； 3. 许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达； 4. 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。,大肠杆菌中表达体系的不足： 1. 真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。 2. 真核基因的转录信号同原核的不同。 细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。 3. 真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基因mRNA稳定性。,4. 许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰（正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中并不存在； 5. 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。 6. 大肠杆菌周质内存在各种内毒素。,克隆基因正确表达的基本条件 最基本条件：应该能够进行正常的转录和转译，以及在正常情况下还与转译后加工及新生多肽在细胞中的分布有关。启动子、终止子以及正确读码框（ORF）。,重要条件： 编码的蛋白质产物应能维持正常的稳定性。 具有核糖体结合位点； 具有强启动子； ,二、大肠杆菌的表达载体,1、大肠杆菌表达载体的基本成分,外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理,启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数,转录水平,翻译水平,（1）启动子,要使克隆的外源基因高水平表达的最佳启动子，必须具备以下几个条件：,1）必须是一个强启动子。,2）这个启动子应能呈现一种低限的基础表达水平。使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件。,3）这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导，如物理（如热）和化学（如IPTG）诱导 。,（2）转录终止子,* 当上游启动子驱动的转录作用通读过下游启动子时，便会使该启动子的功能受到抑制。启动子封堵作用 * 在克隆基因编码区的3-末端接上一个有效的转录终止子，便能够阻止转录通读。,此外，转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性，从而大大提高蛋白质产物的水平。,（3）翻译起始序列,mRNA转录本5端的独特的结构特征（核糖体结合位点，RBS），是决定mRNA翻译效率的主要因素。,至今，仍未鉴定出通用有效的翻译起始序列的保守结构，但却已经发展出许多种可以用来有效地降低在mRNA转录本5-末端形成二级结构的实验方法，从而提高克隆的外源基因的表达效率。 例如: 在RBS序列中增加AT含量；诱发特异碱基发生定点突变；以及使用翻译偶联系统进行克隆基因的表达。,（4）翻译增强子,大肠杆菌和噬菌体基因中存在一些特殊的序列元件，能够显著地增强异源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率。这类特殊序列元件特称为翻译增强子。,例如：T7噬菌体基因10的前导序列（g10-L）、以大肠杆菌atpE基因为代表的一些mRNA分子5-UTR中的富含U的区段，以及直接位于T7基因起始密码子下游的“下游元件”等。,分子机制不明。,（5）翻译终止密码,对mRNA翻译终止而言，一个必不可少的条件是必须存在终止密码子。因此，在构建大肠杆菌表达载体时，通常安置上全部的三个终止密码子，以便阻止发生核糖体的“跳跃”现象。,已知大肠杆菌格外偏爱使用终止密码UAA，尤其是当连上一个U而形成UAAU四联核苷酸的情况下，翻译终止的效率进一步提高。,2、常用的大肠杆菌表达载体,迄今为止，基因工程学家已经设计并构建了一系列的以原核启动子取代真核启动子的质粒表达载体系统。,最常用的：噬菌体的PL启动子，大肠杆菌的Lac启动子、Trp启动子，以及pBR322质粒的-内酰胺酶启动子等一批强启动子构成的。,三、大肠杆菌的转化方法,操作步骤： （1）将处于对数生长期的新鲜培养物（0.5-0.6OD)，于4, 4000转/分钟离心10分钟，回收细菌细胞； （2）将细胞用0的0.1mol/L CaCl2溶液重新悬浮细胞沉淀，以诱导细胞感受态产生； （3）加入适量的DNA后，于42 热处理90秒； （4）将混合物快速转移到冰浴中，是细胞冷却1-2分钟，加入适当的培养基在37 培养45分钟，使细胞复苏，并表达质粒所携带的转化基因； （5）选择培养基培养，选择转化体。,2、Hanahan转化法,1983年由Hanahan设计。它的特点是在感受态细胞的诱导方面，除了用CaCl2和MnCl2等二价离子按一定形式组合方式处理细胞外，还利用二甲亚砜（DMSO）、二硫苏糖醇（DTT）和氯化六氨合高钴等进一步处理细胞，其它方面与上法相同。,这种方法的优点是形成高频率的感受态细胞，可使转化效率提高100-1000倍，而且对大小质粒都能进行有效的转化。,值得注意的是：此法要求的条件高，对外界污染物极其敏感，对各方面的要求很高。因此，只在极少数情况下才使用此法。,3、电转化法,电转化法的转化效率受电场强度、电脉冲的时间和DNA浓度等参数的影响。,转化效率：108-109转化体/g DNA。, 当电压和电脉冲时间的一定方式组合而导致50%-70%细菌死亡时，转化效率达到最高。, 制备用于电转化的感受态细胞相对容易。 当细菌长到对数中期，冷却、离心，然后用冷却的去离子水反复清洗，最后用10%甘油重悬细胞，使其浓度为31010细胞/毫升，在干冰或液氮中速冻后置于-70 贮存。, 转化必须在0-4 下进行。 如果在室温下操作，转化效率会大大降低。,四、克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达,1、外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位,* 克隆在大肠杆菌细胞中的外源基因的表达部位： 细胞质；细胞周质；分泌到细胞外,这三种表达部位各有不同的优缺点，而且对表达量和表达产物的制备有很大关系。,在大肠杆菌细胞不同部位表达外源蛋白质的优缺点,表达部位 优点 缺点,细胞质 1、 形成包涵体 1、蛋白质折叠了可能无法恢复起生物学活性 （1）蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离 2、还原的环境不利于二硫键的形成 （2）蛋白质受保护而免受胞内酶的降解 （3）蛋白质没有活性，不会使细胞受伤害 2、表达的质粒载体构建比较简单,周质 1、周质中蛋白质种类较少，纯化简单 1、信号肽并非总是有助于蛋白质的转运 2、蛋白质酶解程度不严重 2、有可能形成包涵体 3、促进二硫键的形成及蛋白质的折叠 4、蛋白质N-末端结构真实,胞外 1、蛋白质的酶解作用程度很底 1、在大肠杆菌细胞中表达的外源真核蛋白通 2、目标蛋白的纯化容易，由于分泌到胞外的 常不会分泌到胞外 蛋白种类少 2、由于分泌到胞外的蛋白质相当于稀释，因 3、增进了蛋白质的折叠作用 此目标蛋白的得率较低 4、蛋白质N-末端结构真实,* Talmadge和Gilbert（1982）将外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的不同部位表达。结果： 细胞质中表达的大鼠胰岛素原的半衰期仅有2min左右，而表达在大肠杆菌周质中大鼠胰岛素原的半衰期延长了10倍以上。（原因：细胞周质中蛋白酶的含量低）,到目前为止，这方面的技术还很不成熟，外泌率低。,* 使克隆基因表达的外源蛋白质分泌到胞外的培养基中，是获得蛋白质稳定性的最佳途径。,2、外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的稳定性,当一种克隆的外源基因在大肠杆菌中不能实现其功能表达时，我们往往会认为这是由于转录或翻译过程发生了问题。其实在早期的研究中就有许多实验表明，克隆的外源基因即便是在大肠杆菌中得到了表达，也并不一定就意味着它的多肽产物是稳定的。,影响因素包括：,（1）蛋白质的降解作用,在大肠杆菌的细胞中，含有大量的各种类型的蛋白酶，广泛分布在细胞质、周质、内外膜等部位，参与许多方面的代谢活动，包括选择性地酶解异常的蛋白质。,已知有许多因素，如不完全多肽、氨基酸取代突变、多酶复合体亚基的超量合成、氧化作用或游离自由基的作用而造成的翻译后损伤，以及基因工程技术的效应等，都可以导致蛋白质分子受损或构型变化，形成异常蛋白质。,为了避免在大肠杆菌中发生外源蛋白质的降解，或将此降解作用控制在最低水平，已针对性发展出了许多种不同的技术方案。主要有：,1）让外源蛋白质定位在周质或胞外表达； 2）使用蛋白酶缺陷的大肠杆菌做表达菌株； 3）将转化有克隆基因的寄主菌株放置在低温环境中生长； 4）使目标基因以融合蛋白形式表达； 5）置换多肽链中某些氨基酸，消除蛋白酶切点； 6）对目标蛋白质作疏水性修饰。,（2）结构决定因子与蛋白质的稳定性, 与蛋白质稳定性相关的确切的分子结构特征？ 不清楚, 但已经明确了若干种影响蛋白质稳定性的结构决定因子。 其中最重要的：N-端氨基酸性质。,N-端氨基酸性质,“N-端法则”: 在生物体内蛋白质新陈代谢的稳定性，主要取决于N-端氨基酸的性质。 在大肠杆菌细胞质内，若蛋白质N-端为Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr 和Trp等残基，则其稳定性较差；而同样条件下，若N-端为除了前述6种氨基酸之外的其它任何一种氨基酸残基时，其稳定性则大大提高。, 重组操作时， N-端增加一个增加稳定性的氨基酸,（3）表达天然的蛋白质,以形成融合蛋白的形式在大肠杆菌细胞中表达外源真核基因具有许多方面的优越性。例如，产物比较稳定，可以免受胞内蛋白酶的降解作用，可以获得较高的产率。,Tacon等人在80年代初期，使用大肠杆菌的trp启动子和与之相连的SD序列，构建了两种有利于表达天然蛋白质的质粒载体。pWT551和pWT571,（4）分子伴侣（molecular chaperone）稳定作用,分子伴侣：指一类多功能蛋白质，它能够通过阻止诸如聚合作用这样的副反应，来促使其它蛋白质按正确的方式折叠，而其本身却不是最终形成的功能蛋白质的组成成分。,通过分子伴侣与克隆的外源基因在大肠杆菌寄主细胞中共表达是增强目标蛋白的稳定性、实现高水平表达的有效方法。,（5）大肠杆菌突变体菌株与蛋白质的稳定性,通过产生融合蛋白途径增加外源多肽稳定性的方法，已有许多文献报道，但此法的一个突出缺点是所产生的融合蛋白并不一定都能够在体外将天然蛋白质完整无损地切割下来。,一种相当有效的变通办法是，使用胞内蛋白酶含量很低的大肠杆菌突变株，作为表达外源蛋白质的寄主细菌。其中用得最多的是缺失lon蛋白酶的大肠杆菌突变株。,五、影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素,启动子的强度、DNA转录起始序列、密码子的选择、mRNA分子的二级结构、转录的终止、质粒的拷贝数以及质粒的稳定性和寄主细胞生理特征等都会不同程度地影响克隆基因的表达效率。,1、启动子对克隆基因表达效率的影响,(1) 启动子结构对表达效率的影响,大肠杆菌启动子的序列结构具有两个保守序列，即-35区（5-TTGACA）和-10区（5-TATAAT），后者又叫Pribnow盒。,应用半乳糖激酶系统检测结果表明：启动子序列与上述保守序列之间相似程度越高，其表达能力也就越强，两者呈正比关系。,此外，两个保守序列之间的距离也影响克隆基因的表达效率，这段间隔距离越接近于17个碱基，启动子的活性就越强。,（2）启动子与克隆基因的间隔距离对表达效率的影响,Roberts等用plac5.1 DNA的含有lac启动子和SD序列与cro基因表达序列构建了不同间隔距离的重组质粒载体。从中挑选了9种不同的重组质粒载体，分别转化大肠杆菌细胞，然后测定各种克隆所产生的cro蛋白质含量，同时也对每种质粒中的连接lac-cro基因的结合区序列进行测定。,ACAATTTCACAGGAAACAGGATCCGGGACTATTTTACCTATGGCGGTGATAATGGTTGCATGTACTAAGGAGGTTGTATG TGTTAAAGTGTCCTTTGTCCTAGGCCCTGATAAAATGGATACCGCCACTATTACCAACGTACATGATTCCTCCAACATAC,BamHI,从lac启动子开始转录,Cro转译起始密码,SDlac,pTR213,pTR199,pTR214,pTR188,pTR194,pTR210,pTR182,pTR190,1.63,0.085,1.00,0.65,0.51,0.85,0.0012,0.0006,* 图中示出 pTR161质粒的从lac启动子到cro基因转译起点间的碱基序列。还示出pTR161质粒的8种派生质粒的序列缺失程度。数字表示相对于pTR161的蛋白质合成数量。,结果表明：携带不同重组体质粒的菌株所合成的cro蛋白质数量，是同lac-cro基因的结合区序列相关联，但这种相关性并没有一定的规律；但 5端与SD序列之间的距离应15bp。,（3）提高克隆基因表达效率的实验方案,2、质粒载体的生物学特性与基因表达效率,（1）质粒的拷贝数,由于细胞中的核糖体数量与任何一种mRNA分子数量相比，都是大大超量的。因此，增加mRNA分子数量是提高克隆基因表达效率的有效途径。,增加mRNA分子数量的因素有两种：1）启动子强度；2）基因的拷贝数，即基因剂量；最简易的方法是将基因克隆到高拷贝的质粒载体上。,质粒的拷贝数受质粒复制控制区和宿主菌的遗传背景影响。迄今所使用的绝大多数高拷贝数的质粒载体，都是由ColE1衍生而来的。 ColE1及其衍生质粒的复制，受两种负调节成分的控制：RNAI和Rom蛋白质。,RNAI是由ColE质粒DNA编码的长度为108 nt的不翻译RNA分子，它通过干扰RNAII的加工来抑制质粒的复制。,Rom蛋白是由ColE质粒rom基因编码的一种反式作用抑制剂，它可形成二聚体增强RNAI和RNAII之间的碱基配对，从而抑制引物的形成。,因此， rom基因的缺失或RNAI基因的突变，都会引起质粒拷贝数的增加。,（2）质粒载体的不稳定性对表达效率的影响,质粒分离的不稳定性是指质粒缺陷性分配引起的质粒丢失现象。,天然质粒都可以稳定地保持在寄主细胞内，这是由于它们具有一段分配功能区Par所致。分配功能区Par能够保证质粒分子在每次细胞周期中都能准确地分离，并均匀地分配到子细胞中去。,克服质粒丢失的方法：,1）将Par克隆到表达载体；,2）对无质粒细胞进行反选择。大体步骤为：使携带目的基因的质粒同时带上编码启动子的cl基因，形成特殊的重组质粒。然后用一种启动子缺陷的突变体感染携带这种重组体质粒的大肠杆菌寄主细胞，使之成为溶源性细菌。在这种溶源性细菌中，重组质粒的丧失，伴随着发生阻遏物的丧失，则原噬菌体便被诱发进入溶菌生长周期，从而使寄主细胞裂解死亡。,3、mRNA转录本的分子特性对基因表达效率的影响,（1）翻译起始系列对表达效率的影响,许多细菌基因起始密码子5上游都存在510个核苷酸的核糖体结合位点（RBS），特称为SD序列。它包含5-UAAGGAGG-3的全部或其中一部分。, 已经鉴定出SD序列与16S rRNA分子之间的碱基互补程度，可明显地影响mRNA的翻译速率。当此序列为5-GGAGG-3时，可与16S rRNA 3端区段完全互补，翻译效率最高；而当该序列发生单碱基突变时，翻译效率便下降30倍之多。, 连接在SD序列后面的4个碱基成分的改变，会对翻译效率发生很大影响。如果这个区域是由4个A或4个T碱基组成，其翻译最有效；而当是由4个C或4个G碱基组成，翻译效率则只及最高翻译效率的50%或25%。, 直接位于起始密码AUG上游的三个碱基的三联体组成，同样也对翻译效率发生影响。以-半乳糖苷酶mRNA的翻译为例，当这三联体组分为UAU或CUU时，翻译效率最高；而如果是UUC、UCA或AGG时，翻译水平下降20倍。,(2) mRNA的稳定性对表达效率的影响,mRNA的稳定性是指mRNA分子的相对寿命，或对内源RNase降解作用的抵抗能力。,在细菌细胞中，有两类不同的核糖核酸酶参与mRNA降解作用：核糖核酸内切酶（RNaseE、RNaseK和RNaseIII）和核糖核酸外切酶（RNaseII和PNPasepolynucleotide phosphorylase）。,在不同种类的细菌中，这些核糖核酸酶的含量比例不同。例如，在大肠杆菌细胞中，90%的外切核酸酶是RNaseII；而在枯草杆菌细胞中，占绝对优势的外切核酸酶是PNPase,为了维护自身的稳定性， mRNA 分子在进化过程中也形成了两种保护性结构元件：5-UTR系列和3-UTR系列以及顺反子间区（intercistronic region）的茎环结构。,将大肠杆菌mRNA分子的某些保护性结构元件与外源mRNA融合，便可起到稳定剂的作用。,4、遗传密码子的使用对基因表达效率的影响,（1）密码子使用的偏爱性,遗传密码有简并性，即一种氨基酸有数个同义密码子；例如，亮氨酸共有6个密码子。,无论真核基因还