课件：医学分子遗传学第五章基因表达调控.pptx

第五章 基因表达调控,医学分子遗传学,RNA与转录调控 真核生物的RNA种类与不同的RNA聚合酶 活性染色质结构是基因转录的前提 转录过程与调控 起始 延伸 终止 转录后水平的调控 RNA的剪接与加工 RNA的转运,翻译与调控 核糖体组成与结构 氨酰tRNA携带正确的氨基酸 密码子与反密码子的识别 翻译的起始、延伸与终止 翻译水平的调控 mRNA稳定性与降解 microRNA对翻译的负调控作用 特异信号应答性翻译水平的调控（如转铁蛋白） 翻译后调控（蛋白质的命运选择）成熟、分选、降解,本章内容提要,基因表达（gene expression）,与RNA序列一致的DNA链称为编码链/+链 与RNA序列反向互补的DNA链称为模板链/-链,RNA与转录调控,结构性RNA（占细胞总RNA的95%） 核糖体RNA（Ribosomal RNA，rRNA） 转运RNA（transfer RNA，tRNA） 核小RNA （small nuclear RNA，snRNA） 核仁小RNA （small nucleolar RNA，snoRNA） 功能性RNA（不均一RNA，占细胞总RNA的5% ） 信使RNA（messenger RNA，mRNA）及其前体 非编码RNA（non-coding RNA）及其前体 microRNA lncRNA （long non-coding RNA）,真核细胞中的RNA种类,Ribosomal RNA（rRNA） 组成核糖体核酸组分 真核生物包括28S、18S、5.8S（以前体形式转录为45S RNA，经剪接加工后产生）和5S rRNA 存在多种碱基修饰 提供核糖体骨架和催化活性位点 占细胞RNA总量的80%,transfer RNA（tRNA） 大小：7090nt，存在多种碱基修饰 种类：约80种，约占细胞RNA总量的15% 结构 二级结构三叶草，“三环一臂”（D环、TC环、反密码子环、（额外环）、氨基酸臂3末端 CCA+Amino acid） 三维结构“L”型 功能：运载氨基酸至核糖体进行蛋白合成,核小RNA（small nuclear RNA，snRNA） 以核糖核蛋白颗粒（snRNP）形式存在于细胞核内 包含U1、U2、U4、U5、U6成员 功能：与蛋白结合形成剪接体（spliceosome），参与mRNA前体的剪接（splicing）,细胞质小RNA（small cytoplasmic RNA，scRNA） 可能与snRNA同源，以核糖核蛋白颗粒（snRNP）形式存在于细胞质 如7SL RNA组装形成信号识别颗粒（signal recognition particle， SRP），参与蛋白转运,核仁小RNA（small nucleolar RNA，snoRNA） 独立转录或来源于其他转录基因的内含子 包括H/ACA型和C/D型两种主要类型，共约40种 参与rRNA的剪切、加工（碱基修饰）与核糖体的组装,H/ACA型,C/D型,信使RNA（messenger RNA，mRNA）遗传信息的传递者（编码蛋白产物） 成熟mRNA 5端具有帽子结构 3 端有polyA尾巴 mRNA中包含蛋白读码框 （open reading frame，ORF /coding sequence，cds） 非编码RNA（non-coding RNA） 无蛋白读码框,microRNA,大小：22nt 细胞定位：主要胞质 前体与加工 primary miRNA：数百或数千nt，包含一个或多个microRNA前体 Drosha酶切割precursor miRNA（70nt，茎环结构） 转运出核（Exportin5） Dicer酶切割成熟miRNA 功能 形成RNA诱导沉默复合物（RNA induced silence complex，RISC） 通过与mRNA3UTR碱基互补配对（部分配对），抑制靶基因mRNA翻译 完全配对靶mRNA降解,长非编码RNA （long non-coding RNA， lncRNA） 长度200bp ，无读码框，属不均一RNA 预测占基因组4%9% 转录形式（来源）多样：正向、反向、双向、内含子中、基因间 功能多样,抑制基因转录,促进异染色质形成,转录形式（来源）多样,RNA是由RNA聚合酶（RNA polymerase）催化合成的。 以DNA为模板合成RNA的过程称为转录（transcription） 真核生物含有三种RNA聚合酶 RNA polymerase转录45S rRNA前体（结构性RNA） RNA polymerase转录mRNA、pri-microRNA、lncRNA（不均一RNA，功能性RNA），snRNA（U1U5）、snoRNA RNA polymerase转录tRNA、5S rRNA、snRNA（U6）、少部分microRNA（小RNA，结构性RNA） 每种RNA聚合酶都包含多个亚基（12个），聚合体总分子量超过500kDa。,真核生物的RNA聚合酶,Example：Structure of RNA polymerase,启动RNA转录的必要条件 染色质重构产生活性染色质结构 反式作用因子（转录因子、辅激活子）识别并结合启动子/增强子上的顺式作用元件 募集特定RNA聚合酶到转录起始点 转录过程 起始（initiation） 延伸（elongation） 终止（termination） RNA转录后需进行加工与转运,RNA转录过程与调控,启动RNA转录前需克服染色质的表观修饰障碍,基因由表达关闭状态（非活性状态）转变为活性状态（允许转录）,发生在转录起始前调控染色质重构（chromatin remodeling） BRG1-Swi/SNF complex 结合于染色质特定位点（具 有基因与DNA序列特异性） BRG1-Swi/SNF complex 引发核心组蛋白相对DNA 的滑动或解离（被置换） 一段含有特定序列（顺式作 用元件）的游离双链DNA 被暴露，被特异性转录调控 复合物识别结合，启动转录,启动子与增强子包含顺式作用元件 顺式作用元件（cis-acting element）：位于基因的旁侧，可以调控基因表达的核酸序列。 启动子（promoter）：位于转录起始点附近（通常位于起始点上游200bp的范围内），且为转录起始所必需的序列元件。 增强子（enhancer）：位于距离转录起始点较远的位置上（通常几kb至几十kb），具有参与激活和增强转录起始功能的序列元件。 启动子和增强子可含有同样的顺式作用元件，通常增强子上元件密度更高，调控的组织特异性更强。,增强子的特点： 可位于基因上游或下游发挥作用 通常DNA序列颠倒也可以发挥作用 通过空间构象上接近使激活转录的因子相互作用以激活/增强基因转录,启动子和增强子中常见的顺式作用元件 启动子（型启动子）中的基础元件（Basal level element，BLE） TATA Box：位于-25-30bp，TATAAAA /TATATAT，与基础转录因子TBP结合，启动基因转录。 GC盒（GC Box）：位于约-35bp ，GGCGG，与转录因子SP1结合，促进转录的过程。 CAAT盒（CAAT Box）：位于-70-80bp，GG C/T CAATCT，与CTF结合，决定启动子转录效率。 一个基因的启动子 和增强子中可存在 多种不同应答元件， 其转录受到多种刺 激信号的协同调控,启动子和增强子中存在各种特异性应答元件（response element），如血清应答元件（Serum response element，SRE）等,反式作用因子识别并结合暴露的启动子/增强子元件 反式作用因子（trans-acting factor）：能直接或间接地识别并结合在各类顺式作用元件核心序列上，对基因表达发挥不同调节作用（激活或抑制）的各类蛋白质因子。 反式作用因子的结构特点：通常具有相互独立的DNA结合结构域和转录调节结构域（蛋白相互作用结构域） 反式作用因子的分类 基本转录因子（basal factor）：不是RNA聚合酶核心酶成分，但与RNA聚合酶直接发生相互作用，基本转录复合体决定了转录起始位点（例：TBP，TATA box binding protein，负责募集RNA聚合酶核心酶）。 激活剂（activator）：特异性识别短共有序列元件的转录因子，结合于启动子或增强子的特异位点上。 辅激活剂（co-activator）：本身并不与DNA结合，负责连接激活剂与基本转录复合体。 抑制子（repressor）：结合DNA特定位点，抑制基因表达。,反式作用因子中常见的DNA结合结构域,锌指结构（Zinc finger motif）,同源盒结构域（Homeodomain）,两性螺旋-环-螺旋 （helix-loop-helix，bHLH）,反式作用因子中介导蛋白相互作用结构域亮氨酸拉链（Leucine zipper，通过蛋白间的疏水作用相互结合）,反式作用因子的活性通常受到调控 常见的反式作用因子 活化方式 新蛋白合成 蛋白磷酸化 蛋白去磷酸化 蛋白与配体结合 反式作用因子与抑制 子解离 反式作用因子的结合 蛋白发生改变 蛋白原切割产生反式 作用活性,基因转录起始前的调控概览,糖皮质激素进入细胞与糖皮质激素受体（GR）结合 GR被激活转位入核 活化的GR识别顺式 元件GRE，激活靶基 因转录,基因转录调控举例 糖皮质激素（glucocorticoid）激活的基因转录,转录起始（initiation）TBP是正确定位RNA聚合酶的关键 型启动子（RNA polymerase） 具有上游启动子元件（upstream promoter element）和核心启动子元件（core promoter） 核心结合因子中包含TBP，负责募集核心酶（Pol） 型启动子（RNA polymerase） 1/2型启动子：TFA/C结合顺式元件boxA/B/C（位于转录起点下游），并募集TFB（包含TBP亚基），TFB募集核心酶（Pol）启动转录（5S rRNA，tRNA） 3型启动子：TBP直接结合于TATA-box，在其他元件协助下募集核心酶启动转录（snRNA U6） 型启动子（RNA polymerase） 持家基因组成型表达，多数基因具有组织表达特异性 TFD包含TBP，结合TATA-box，并募集核心酶（Pol） 许多激活剂/辅激活剂通过与TFD结合募集核心酶,转录过程起始、延伸与终止,TF：transcriptional factor,转录延伸（elongation） RNA聚合酶（RNA polymerase）的C末端结构域（CTD）被磷酸化，使转录起始复合物解体，RNA聚合酶开始延伸 延伸过程中核小体被置换 CTD结构域中不同位点的磷酸化提供多种不同信号，介导转录延伸过程与各种RNA加工过程（5加帽、剪接、3 加polyA尾巴等）相偶联,转录终止（termination） RNA polymerase在18个碱基终止子序列处终止转录，3末端经由核酸内切酶在终止位点上游1000bp处切割产生 RNA polymerase在GC富含序列中的poly（U）4序列处终止转录 RNA polymerase没有专一性的终止子区域，RNA 3端由核酸内切酶切割和多聚腺苷酸化产生 内切酶特异性识别加尾序列：AAUAAA， 并在其后某个位置切断正在合成的RNA 分子 腺苷末端转移酶（PAP）催化在RNA分 子3断端处逐个添加腺苷残基，形成 polyA尾巴 复杂的蛋白复合物参与切割与加尾反应 polyA尾通常长约200nt,rRNA的切割与修饰 45S rRNA前体经核酸内切酶、3-5核酸外切酶与5-3核酸外切酶的共同切割产生成熟的28S、18S与5.8S rRNA rRNA中特定位点的甲基化修饰通过snoRNA与rRNA的序列配对实现 rRNA中的假尿嘧啶（）由snoRNA与rRNA的序列配对和假尿嘧啶合成酶的催化产生 tRNA的剪接与加工 tRNA前体经连续的酶促切割和重连反应去除内含子 tRNA经酶促化学修饰产生稀有碱基（次黄嘌呤I、等） mRNA前体（不均一RNA）的加工 5端形成帽子结构：m7GpppApN 3端形成polyA尾巴 内含子经由snRNP催化的转酯反应剪接去除 mRNA个别碱基甲基化与mRNA编辑（罕见）,RNA转录后的加工,mRNA前体（不均一RNA）内含子的去除RNA splicing 内含子的边界GU-AG规则 剪接位点（GU-AG）被线性成对识别，错误配对造成外显子丢失,剪接过程通过snRNP（U1U6）催化RNA的转酯反应完成【mRNA前体序列提供剪接信息，snRNP提供剪接机器（spliceosome）】 内含子序列3 端含有保守序列，称分支位点（branch site），提供转酯反应的受体位点（一个A残基） 剪切下来的内含 子包含5-2磷酸 二酯键，呈套索 状（lariat）被 释放 某些被剪切下来 的内含子具有独 立的功能,branch site,mRNA个别碱基的甲基化：snoRNA可能参与 mRNA编辑（RNA editing）：在mRNA水平上发生遗传信息改变的过程。 碱基置换：载脂蛋白B（ApoB） mRNA C2153U，由脱氨酶催化 碱基插入或删除：由向导RNA指导（如锥虫线粒体cox mRNA）,RNA转运至细胞中正确的场所是发挥正常功能的前体 各种RNA的出核/入核转运依赖不同的核转运蛋白 mRNA出核转运与内含子剪接加工相偶联（剪接过程使某些蛋白在剪接后保留在mRNA上，形成新的蛋白-RNA复合物介导RNA的出核转运和其他功能）,RNA转运,小结RNA的合成、定位与功能,蛋白翻译与调控,mRNA翻译的场所核糖体（Ribosome）,翻译（translation）：以mRNA所携带的遗传信息指导蛋白质合成的过程。 真核生物核糖体的构成 60S大亚基：28S（4718nt）、 5.8S（160nt）、5S（120nt） rRNA+49种蛋白质 40S小亚基：18S（1874nt） rRNA+33种蛋白质 全核糖体80S，由大亚基和 小亚基结合而成,核糖体的结构特点 核糖体提供了mRNA与tRNA相互作用的界面 核糖体相对mRNA移动方向53（读取密码子） tRNA在核糖体中的移动方向A site P site E site（卸载/转移氨基酸到新生肽链） A site：氨酰tRNA位点 （Aminoacyl-tRNA） P site：肽酰tRNA位点 （Peptidyl-tRNA） E site：空载tRNA位点 （Empty tRNA）,氨酰tRNA空载tRNA循环,空载tRNA加载特异氨基酸由氨酰-tRNA合成酶催化 氨酰tRNA在核糖体中将所携带的氨基酸转移到新生肽链上,氨酰tRNA合成酶对特异性氨基酸和tRNA的识别,tRNA的共性：结构相似，都能够进入核糖体的A位和P位 tRNA的特性：结构细节上的变化区分不同tRNA tRNA的冗余性：一种氨基酸通常对应多个tRNA 携带同种氨基酸的不同tRNA称同工tRNA（isoaccepting tRNA） 共20组同工tRNA 每种氨酰tRNA合成酶识别一 种氨基酸和一组同工tRNA tRNA识别机制 反密码子 接受臂最后三个碱基对 识别子（discriminator）碱基 空间构象 每种tRNA具有独特的识别规则,密码子与反密码子的相互识别摆动假说（wobble hypothesis）,密码子与反密码子的配对原则密码子与反密码子配对时前两位的碱基是按常规碱基配对原则配对，而第三位碱基配对发生摆动现象（G-U，I（次黄嘌呤）-U/C/A配对）,密码子的使用编码相同或相似氨基酸的密码子前两位往往相同，密码子最后一位碱基通常具有简并性（degeneracy），即密码子最后一位碱基不参与决定编码的氨基酸,真核细胞mRNA翻译（蛋白合成）机制,翻译的起始（initiation） 起始密码子AUG，起始子tRNAiMet不同于普通tRNAMet 起始过程需特异起始因子（eIFs）参与 40S小亚基结合mRNA5端，扫描mRNA直至找到翻译起始点 翻译的延伸（elongation） 延伸过程需特异延伸因子（eEFs）参与 延伸过程中：氨酰tRNA A site P site E site转位， 新生肽链P site A site转位 60S大亚基rRNA提供肽基转移酶活性 翻译的终止（termination） 终止密码子：UAA、UAG、UGA 释放因子（eRF）识别A位点终止密码子，解体翻译复合物，释放 新生肽链,43S complex,48S complex,40S Small subunit，eIF2-Met-tRNAi，eIF3,扫描的结果： 在翻译起点处40S小亚基与60S大亚基组装为80S完整核糖体 Met-tRNAi被定位在核糖体P位点,翻译的起始（initiation）核糖体小亚基沿mRNA 5-UTR扫描（Scanning），直至定位于正确的翻译起始点,翻译的延伸（elongation） EF-Tu装载氨酰tRNA至核糖体A位点 EF-Ts负责EF-Tu -氨酰tRNA 再生 60S大亚基催化新的肽键形成 EF-G结合核糖体A位点，驱动肽酰-tRNA转位至P位后解离 空载tRNA由E位释放,翻译的终止（termination） 释放因子RF1/2识别3种终止密码子，由RF1提供水分子代替氨酰tRNA进行肽转移反应，使翻译终止。 核糖体再循环因子RRF使tRNA、mRNA、核糖体大小亚基解离，新生肽链释放。,翻译过程中动态结合A位点的调节蛋白（EF-G、RF、RRF）都具有与EF-Tu-氨酰tRNA相似的结构,核糖体循环解体后的大小亚基参与新一轮翻译起始，一条mRNA上可同时有多个核糖体进行蛋白合成,mRNA翻译的调控,影响mRNA翻译效率的内在因素 mRNA半衰期（mRNA稳定性）影响蛋白合成总量 mRNA 5非翻译区二级结构影响翻译起始效率 起始密码子AUG周边序列（Kozak consensus）影响翻译起始效率 决定mRNA稳定性和翻译效率的信息存在于mRNA序列自身 翻译水平的特异性调控 microRNA对靶mRNA翻译的衰减调控（序列特异性） 特异因子应答性翻译水平的调控（转铁蛋白） 蛋白产物对自身mRNA翻译的自反馈调控,起始密码子AUG周边序列（Kozak consensus sequence）影响翻译起始效率 Kozak规则：起始AUG侧翼序列具有偏好性碱基分布 (1) +4位偏好碱基为G (2) -3位偏好碱基为A 满足Kozak规则能够增加翻译效率 Kozak序列不是翻译起始所必需 核糖体小亚基扫描时会越过不能起始翻译的AUG序列，寻找下一个合适的翻译起始位点（渗漏扫描，leaky scanning）,细胞处于低铁离子环境中，IRE结合蛋白识别并结合Ferritin mRNA 5 UTR的IRE，mRNA形成高级结构，阻碍了核糖体小亚基的扫描，因而抑制转铁蛋白翻译。 细胞处于高铁离子环境， IRE结合蛋白结合铁离子，构象变化，与IRE解离，mRNA翻译启动。 IRE：铁应答原件,转铁蛋白（Ferritin）mRNA的对环境铁离子浓度变化特异性应答的翻译调控机制,蛋白产物对自身mRNA翻译的自反馈调控 例：核糖体蛋白（r-protein）的自反馈翻译调控机制,核糖体蛋白（r-protein）与rRNA结合共同组成核糖体 当细胞内无游离r-protein时，蛋白翻译正常进行 当r-protein过量翻译时，游离r-protein结合于自身mRNA，抑制翻译进行,意义：精细调控细胞内资源的利用，避免资源浪费，类似的调控方式还有微管蛋白单体,microRNA对靶mRNA的翻译调控 microRNA与靶mRNA的3非翻译区（3 UTR）不完全互补配对，通过RISC复合物抑制mRNA翻译（具有序列依赖与性序列特异性） 核心配对区：microRNA 5端2-8位核苷酸 microRNA与靶mRNA完全互补配对导致mRNA降解（高等动物不常见）,Competing endogenous RNA (ceRNA) network,translation,proteomics,翻译后调控蛋白质的转运定位与命运选择,游离核糖体合成的蛋白 胞质蛋白、胞核蛋白、过氧化物酶体蛋白 分子伴侣辅助折叠 折叠、切割、修饰（磷酸化等）在胞质完成，成熟后的蛋白被转运到特定细胞器 线粒体/叶绿体蛋白 翻译后保持未折叠状态 先定位到特定亚细胞结构，再进行切割（导肽）、折叠 内质网结合核糖体合成的蛋白 膜结合蛋白与分泌蛋白 翻译中的肽链提供定位信号，翻译与蛋白转位相偶联 在内质网与高尔基体中进行蛋白加工（糖基化、脂酰化、折叠、切割等） 蛋白降解泛素蛋白酶体途径,原核生物的基因表达调控与抗感染策略,原核生物启动子与基因转录,RNA聚合酶直接识别启动子-35区 -10区解开DNA双链 在起始点启动RNA合成 亚基：增加核心酶与DNA的特异性结合，转录起始后与核心酶解离，使核心酶能够沿DNA链移动,亚基,亚基决定RNA聚合酶对启动子的特异性识别,对比原核生物与真核生物的RNA聚合酶与转录机制,原核生物与真核生物核糖体构成的差异,原核生物翻译起始机制,SD（Shine-Dalgarno）序列：位于起始密码子上游10nt，嘌呤六聚体（如AGGAGG） 小亚基16S rRNA 3端一段序列与SD序列互补配对 翻译起始过程 IF1、IF3结合30S小亚基 30S小亚基结合mRNA的SD序列 IF2将起始子tRNA带入P位 IF3被释放，IF1、IF2被释放 50S大亚基结合形成完整核糖体（70S）,原核生物转录与翻译、降解过程相偶联,对比原核生物与真核生物翻译过程,一些临床常用抗生素的作用靶点,DNA复制抑制：氟喹诺酮类（诺氟沙星，Norfloxacin） 转录抑制：利福霉素类（利福平，rifampicin） 翻译抑制： 大环内酯类（红霉素，erythromycin） 氨基糖苷类（庆大霉素，gentamicin；链霉素，streptomycin） 四环素类（tetracyclines） 氯霉素（chloramphenicol） 抗生素的作用机理：针对原核生物与真核生物基因表达系统结构上的差异，特异性抑制细菌的基因表达（蛋白合成）与增殖,喹诺酮类（fluoroquinolones）抗生素,作用靶点：DNA促旋酶（DNA gyrase）A亚基 作用机制：嵌入断裂DNA链中间，抑制促旋酶切口和封口功能，从而抑制DNA复制 代表性药物：诺氟沙星（氟哌酸）、环丙沙星,诺氟沙星,环丙沙星,利福霉素类（rifamycin）抗生素,作用靶点：原核生物RNA聚合酶 作用机制 结合RNA聚合酶亚基的一个“口袋” 结合位点距酶活性中心约1.2nm，但阻止了RNA链延伸 通过阻止RNA链延伸超过23碱基从而阻止RNA转录的发生,利福平（rifampicin）,大环内酯类（macrolides）抗生素,结合靶点：细菌核糖体50S大亚基 作用机制：抑制肽酰-tRNA由A到P移位，阻止氨酰-tRNA进入A位，进而抑制蛋白合成 代表性药物：红霉素（erythromycin），罗红霉素（roxithromycin）,罗红霉素,红霉素,氨基糖苷类（aminoglycosides）抗生素,结合靶点：核糖体30S小亚基 作用机制 抑制30S翻译起始复合物形成 抑制70S完整核糖体形成 引起密码子与反密码子错配，导入错误氨基酸，产生无功能蛋白 代表性药物 链霉素（streptomycin） 庆大霉素（gentamicin）,链霉素,庆大霉素,四环素类（tetracyclines）抗生素,作用靶点：细菌核糖体30S小亚基A位 作用机制：阻断氨酰-tRNA进入A位，抑制肽链延长，使蛋白合成终止,氯霉素（chloramphenicol）,作用靶点：细菌核糖体50S大亚基 作用机制：抑制转肽反应，从而抑制蛋白合成,氯霉素,氯霉素,链霉素,红霉素,四环素,几种翻译抑制类临床常用抗生素的作用靶点,Q & A,Revision,真核生物的RNA种类与RNA聚合酶,真核生物含有三种RNA聚合酶 RNA polymerase转录45S rRNA前体（结构性RNA） RNA polymerase转录mRNA、pri-microRNA、lncRNA（不均一RNA，功能性RNA），snRNA（U1U5