REACH法规第四卷译稿-25.doc

B.24. 老鼠的现场测定1. 测定方法1.1. 引言见总体引言部份 E 。1.2. 定义见总体引言部份 E 。1.3. 参考物质无。1.4. 测定的测定方法原则测定中将发育中的老鼠胚胎与化学药物接触，研究的是正在发育的后代数目中的成黑素细胞和对照组毛发颜色的基因。发育中的后代数目是许多对照组毛发颜色基因的杂合体。成黑素细胞基因中占主导地位的遗传突变因子的异变或减少导致遗传细胞的隐性表现型表现为显性，结果产生了皮毛上有不同颜色斑点的老鼠 。记录有斑点的和变异后代的数目及出现的频率，并与仅受溶剂作用的后代数目的后代相比较。斑点鼠实验通过研究后代数目来推测生物体的变异情况。1.5. 质量标准无。1.6. 测定方法描述准备尽可能使测定物质溶解或悬浮于生理盐水中。不溶于水的化学物质使之溶解或悬浮合适的促溶剂中。促溶剂应既不干扰测定物质也不产生毒性。测定物质应为新制的。动物样品T 标记的老鼠(非刺鼠,a/a;南美栗鼠,粉红的眼睛,cchp/cchp;褐色,b/b;浅色的,短耳朵,d se/d se;杂色斑点,s/s) 和HT标记的老鼠交配(苍白的,非刺鼠,brachypody,pa bp/ pa bp;暗色绒毛,ln fz/ln fz;.pe/pe ) 或和C57BL标记的老鼠(非刺鼠,a/a)交配。如果 NMRI(非刺鼠,一/一;白公,c/c) 和 DBA 之间(非刺鼠,一/一;褐色,b/b;稀释的 d/d) 杂交可以产生非刺鼠后代，则这种杂交也可作为一种合适的杂交方式被使用。数量和性别足够的受孕雌鼠为不同剂量水平的实验提供适当数目的存活后代。合适的样本规模受实验中斑点鼠的数目和对照组实验数据的比例。应使迎阴性实验数据结果的比例在最高剂量水平下至多为1/300。阴性和阳性对照组仅受溶剂作用的老鼠与对照组应保持一致。 记录的相同的实验室的对照组实验数据若一致可增加实验的灵敏度。测定的敏感提供它们是同种的。 如果一种化学物质经测定没有可引起变异性却在本实验中表现为可变异性，则在同一实验室中在这种化学物质作用下可获得最新的有阳性对照组。施药测定方法给药途径用药的常用测定方法是用管子插入怀孕雌鼠口中或注入起腹腔中。若合适，还可使吸入药物或其他用药测定方法。配制不同剂量水平的药物至少要用二个剂量水平的药物且包括一种能显示毒性的或降低繁衍能力的药物。对于非毒性化学药品应用其最大的可使用的剂量。实验步骤单个实验通常在怀孕第8，9或10天，以发现阴道鞘状塞子似物质为第一天算起。这些天对应于第7，25，8，25和9，25天，这些天应连续测定。分析幼鼠在出生后的在三到四个星期之间被区别标记为三个不同的层次:（a） 变异起因于的腹腔中部 5 毫米里面的吞噬细胞的被白色标记;(WMVS)（b） 黄色的，刺鼠类,斑点在乳和生殖器官, 咽喉, 腋窝和鼠蹊部区域和在前额中部相关的地方是由无区别(MDS)引起的；（c） 有色的和白色的斑点无规则分布的则认为是由细胞的变异（RS）引起的；所有的三种除了最后一种与基因有关的细胞变异外均需标记，MDS和RS间的微小区别可用荧光显微镜观察样本毛发来区分。应标明肉体形态明显异常的后代。2. 实验数据记录标记后代的总数和有一个或多个预测细胞变异斑点的后代的数目。用合适的测定方法比较药物作用下和阴性对照组的实验数据。实验数据也表明了个体繁衍的基础。3. 实验结果报告3.1. 测定结果报告测定结果报告应尽可能包含下列各项实验数据:- 杂交的亲代血统实验中使用的动物的种类；- 实验和对照组下各含有的怀孕雌鼠数目；- 实验和对照组下的平均出生数和存活数；- 测定化学药品的剂量水平 (s),- 所用溶剂；- 实验进行的第几天怀孕；- 实验测定方法；- 标记后代的总数及实验条件和无药物处理条件下产生 WMVS ， MDS 和 RS 的数目；- 形态异常后代的数目；- 产生RS变异情况和剂量关系,- 统计的评估,结果的讨论,结果的解释。3.2. 实验结果评估和解释4. 参考文献见总体引言部份 B 。B.25. 老鼠遗传性变异测定1. 测定方法1.1. 引言见总体引言部份 B 。1.2. 定义见总体引言部份 B.1.3. 参考物质无。1.4. 测定方法原理老鼠可遗传变异测定发现哺乳动物后代数目中染色体的结构和数目变化并可在子一代中复原。 这种被观察的染色体变异是可以相互遗传的，并且雌性后代的X染色体会减少。含有传递物质的个体和XO-雌鼠的F1代的细胞遗传分析，表明其生殖能力下降。某种传递（X-常染色体间和c-t类间）会引起完全不孕。遗传信息的传递可由细胞生物学原理，通过研究亲代雄鼠或子一代雄鼠或子一代雌鼠的雄性后代的成熟细胞有丝分裂的间期至第一次分裂中期，观察得到。通过细胞遗传学研究指出XO-雌鼠在骨髓细胞的有丝分裂中只有39条染色体。1.5. 质量标准无。1.6. 测定方法的引言描述准备将测定化学药品溶解在生理盐水中。 如果不能溶解则用合适的助溶剂。所用药品需为新制备。所用助溶剂必须既不干扰测定物质也不产生毒性。施药测定方法给药途径施药的常用测定方法是用管导入口腔或注入腹腔。如果可行，也可用其他的施药测定方法。动物样品为易于饲养和繁衍和进行细胞分析，故用老鼠进行实验。不需要特殊的种类，但必须其平均繁衍规模应多于8只且相对稳定。 采用健康的成鼠。动物样品的数量所需动物样品的数目，由其自然繁衍频率和按归纳法的最小比率，可得出一个有效结果所必需的数目。实验通常是分析雄性的 F1 子代。每一剂量至少应该测定500只F1子代的雄性老鼠。 如果也测定雌性的 F1子代 ,则需要雌雄老鼠各300只。阴性和阳性对照组合适的条件对照组参数可从过去的可用记录中得到。若从最近在同一实验室中进行的实验可获得可接受的阳性对照组结果，这些结果就可以作为合适的对照组使用。不同剂量水平药品的配制在一个剂量水平测定范围内, 通常最高剂量产生最小的毒性影响，但是不影响生殖的行为或存活率。 建立剂量/ 反应关系另外还需二份的较低剂量的药品。 对于非毒性化学药品，应使用最大的可用剂量。实验步骤药物处理和杂交时间安排上可有二种处理方式。一次性地将测定物质使用完是最常见的方式。持续使用测定物质35天（每周7天）也可。处理后的交配次数由处理的时间安排决定并要保证对所有的处理的后代数目阶段取样。交配结束后，雌鼠被单独关养起来。记录雌鼠繁殖的日期，后代的数目和性别。分出除了参与实验的外的所有的雄性后代舍弃所有的雌性。可变异杂交的测定通常使用下列两种测定方法之一：- 测定F1子代的 繁殖能力并将可能有遗传信息转移的进行细胞生物分析来证实。 - 对所有F1子代雄性除了已进行繁殖能力测定的均进行细胞生物分析(一)繁殖能力测定繁殖能力下降的Fl子代的可能被用来作为小规模观察或对雌鼠的子宫物质进行分析后代数目观测: 将被测F1子代雄性与不是同一实验中的也不是来自同一群体的雌鼠单独关养起来。交配后的前18天应每天检查笼子。记录后代数目大小和 F2子代的性别并舍之。如果F1 子代的雌鼠被测定且 F2 小的后代数目子代被保留作进一步测定。带有可传递遗传信息的雌鼠可由其后代雄鼠的传递的细胞生物信息分析来证实。 XO- 雌鼠从它们的子代性别比例雄性：雌性为1：1变到1：2可辨别出。在后来的实验过程中，正常的F1子代应从进一步的测定除去，如果第一组 F2 后代数目达到或超过被预定的数值,否则第二组或第三组 的F2 后代数目被观察。若在共计三组 F2 代的观察之后仍不能进一步测定母体雌鼠的子宫物质或直接进行细胞生物学分析，则F1 动物不能正常区分。子宫物质分析:带有可传递遗传信息的后代数目的减少是由于胚胎的死亡以至于引入大量死的细胞从而使可遗传信息的表现低于测定水平。每个被测F1代雄鼠要和两到三只雌鼠交配。每天早上观察其阴道排泄物。雌鼠在 14 到 16 天之后被注入活的和死的细胞组织并记录。(b)细胞生物学分析实验在干燥的空气中进行。可变遗传信息的携带者可通过其细胞分裂间期到第一次有丝分裂中期的极有价值的表现形态来区分。至少观察两个有巨大研究价值的相关细胞来验证。如果均为统一饲养，则所有的F1代雄鼠均要进行细胞生物学分析。对每个雄鼠至少应用显微镜标记25个处于分裂间期到第一次有丝分裂中期的细胞。应观察小睾丸的F1代雄鼠的精细胞或骨髓细胞的有丝分裂中期和有丝分裂的末期。或观察可能为XO雌鼠的有丝分裂中期。每 10个细胞出现一个不寻常的长的和/或 短的染色体表明为特殊的带有不孕遗传信息的雄鼠(c- t 类型) 一些 导致雄鼠不孕的X-常染色体遗传信息只能与染色体的有丝分裂综合分析方可确定。所有的 10个分裂的核均出现 39个染色体是XO雌鼠的证据。2. 实验数据实验数据以表格形式出现。在每个交配间隔及时记录出生和存活的后代的平均数目和性别比例。评估 F1 代动物样品的繁殖能力, 记录所有正常交配的后代的平均数目和含有可遗传信息的F1子一代数目。为分析子宫物质，应记录正常交配的平均存活和死亡数目和F1代中含有可交换遗传信息的个体的平均存活和死亡数目。细胞遗传学分析分裂间期到第一次分裂中期的有特殊意义的形态的数目并列出各种含交换遗传信息个体的细胞数目。对不能生育的F1子代，记录交配的总数和交配持续时段，给出睾丸的重量及细胞遗传学分析的细节。对XO雌鼠，实验结果报告F1子代的平均子代数目、性别比例几细胞遗传学分析结果。可能的F1子代中含有交换遗传信息的个体有生育能力测定预先挑选出来。表格必须包含确定含有交换遗传信息的染色体的数目。3. 实验结果报告3.1. 测定结果报告测定结果报告将尽可能的包含下列各项实验数据:- 老鼠小鼠的表现型种类、年龄