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微生物制备壳聚糖酶的研究进展 微生物制备壳聚糖酶的研究进展 1973年，Monaghan等在研究细菌和真菌过程中，首次提出壳聚糖酶的概念。1992年壳聚糖酶被系统命名为EC3.2.1.132。2004年，国际酶委员对壳聚糖酶重新定义为：一类催化氨基葡萄糖间的β-1，4-糖苷键断裂，从而专一性降解壳聚糖的糖苷水解酶，壳聚糖酶的发现可克服壳聚糖生产成本高和溶解性的缺陷，从而转化为溶解性更优越、溶液稳定性更强、生物活性更丰富的壳寡糖，这就成了现今研究的热点方向。作者结合近年来国内外壳聚糖酶的研究成果，综合分析了壳聚糖酶的分类、性质和制备方法等研究现状。 1 壳聚糖酶概述 壳聚糖酶目前有3种分类方法：底物专一性差别和酶的产生特点。根据底物专一性差别，壳聚糖酶可以分为三类，第一类可以水解GlcN-GlcN键及GlcNAc-GlcN键；第二类只能水解GlcN-GlcN键；第三类既可水解GlcN-GlcN键，又可水解GlcN-GlcNAc键。根据酶的产生特点，可以将壳聚糖酶分为组成型和诱导型。 壳聚糖酶大部分为碱性蛋白，其最适pH本文由收集整理值范围一般在4.08.0。酶的等电点（pI）变化范围大多集中在4.010.1。壳聚糖酶具有较好的热稳定性，最适反应温度在3060。研究发现金属离子尤其是重金属离子对壳聚糖酶活性有不同程度的影响。大部分壳聚糖酶属于内切酶，降解壳聚糖生成壳二糖、壳三糖等寡聚体的混合物，壳聚糖酶在酶解过程中的活性是随着N-乙酰化度、N-取代基团及其不同取代位置以及均相和非均相反应体系而变化的。 2 壳聚糖酶的微生物制备方法 2.1 微生物液体发酵 目前研究公认大多数微生物来源的壳聚糖酶属于诱导酶，因此当以壳聚糖作为唯一碳源时，微生物的产壳聚糖酶的能力就能被诱导出来。一般的液体发酵步骤是通过平板分离初筛和摇瓶培养复筛，从土壤中筛选出产壳聚糖酶菌株，然后经酶活力检测比较，挑选出产酶能力最强的菌株作为产酶试验菌。当然也可通过人工诱变处理来获得高产突变株，最常用的方法是化学法和物理法诱变，可采用单因子诱变处理和复合因子处理。目前对于壳聚糖酶的分离纯化方法主要有（NH4）2SO4分级盐析、Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换、Sephacry S-100凝胶过滤分离等方法。酶活单位定义为每分钟催化生成相当于1μmol氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量。测定壳聚糖酶最常用的方法是DNS法，此外还有粘度法快速测定法和铁氰化钾显色法。对已筛选出的产壳聚糖酶菌种的鉴定一般包括形态学特征鉴定；生理生化特性鉴定；16S rDNA序列分析。由于壳聚糖酶的稳定性不高、寿命短、且无法循环使用，在生产中的应用受到了极大限制，但是通过固定化后上述缺点都可以解决。 2.2 丝状真菌固态发酵 工业上固态发酵是生产酶制剂的主要方式，对于菌丝体有利于保持其自然生理状态和生长，所用培养基和发酵条件更加低廉和简单，而且投资较少；纯化步骤少，产品纯度高，是丝状真菌的一种理想培养方法，糖化工业中以常见的根霉菌丝体替代纯壳聚糖为诱导原料。 思想汇报 2.3 基因工程育种 除了在自然界中继续筛选产酶活性较高的微生物菌种外，现在越来越多的研究人员利用基因工程通过对产壳聚糖酶菌株的基因分析，运用分子方法克隆并高效表达所选菌种的壳聚糖酶基因，以实现重组菌的壳聚糖酶高效表达，具体技术路线如下：根据所选菌株壳聚糖酶基因序列或参照其他菌株的壳聚糖酶基因序列→PCR引物设计，引物合成→提取所选菌株总DNA→PCR扩增获得目的基因→构建原核表达载体→重组菌高效表达条件研究→壳聚糖酶高效表达。 3 研究展望 继续筛选产酶活性较高的微生物菌种的过程中，要合理运用新的诱变方法或进行复合诱变，以减小菌种对诱变方法的抗性，从而获得高产菌株。另外，对发酵条件也要进行优化和改进，筛选出最佳产酶条件，以获得最大的产酶量。另一方面，应该紧跟国际前沿，进一步在分子水平上研究壳聚糖酶的分子