实验室常用溶液的配制.docx

实验室常用溶液的配制130%丙烯酰胺溶液【配制方法】将29g丙烯酰胺和1g N，N-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中。加热至37溶解之，补加水至终体积为100ml。用Nalgene滤器（0.45m孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温。【注意】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。一些价格较低的丙烯酰胺和双丙烯酰胺通常含有一些金属离子，在丙烯酰胺贮存液中加入大约0.2体积的单床混合树脂（MB-1Mallinckrodt），搅拌过夜，然后用Whatman 1号滤纸过滤以纯化之。在贮存期间，丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化成丙烯酰和双丙烯酸。240%丙烯酰胺【配制方法】把380g丙烯酰胺（DNA测序级）和20g N，N-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为600ml的蒸馏水中。继续按上述配制30%丙烯酰胺溶液的方法处理，但加热溶解后应以蒸馏水补足至终体积为1L。【注意】见上述配制30%丙烯酰胺的说明，40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列测定。3放线菌素D溶液【配制方法】把20mg放线菌素D溶解于4ml 100%乙醇中，1：10稀释贮存液，用100%乙醇作空白对照读取OD440值。放线菌素D（分子量为1255）纯品在水溶液中的摩尔消化系数为21，900，故而1mg/ml的放线菌素D溶液在440nm处的吸光值为0.182，放线菌素D的贮存液应放在包有箔片的试管中，保存于-20。【注意】放线菌素D是致畸剂和致癌剂，配制该溶液时必须戴手套并在通风橱内操作，而不能在开放在实验桌面上进行，谨防吸入药粉或让其接触到眼睛或皮肤。药厂提供的作治疗用途的放线菌素D制品常含有糖或盐等添加剂。只要通过测量贮存液在440nm波长处的光吸收确定放线菌素D的浓度，这类制品便可用于抑制自身引导作用。40.1mol/L腺苷三磷酸（ATP）溶液【配制方法】在0.8ml水中溶解60mg ATP,用0.1mol/L NaOH调至pH值至7.0，用蒸馏水定容1ml，分装成小份保存于-70510mol/L乙酸酰溶液【配制方法】把770g乙酸酰溶解于800ml水中，加水定容至1L后过滤除菌。610%过硫酸铵溶液【配制方法】把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中，该溶液可在4保存数周。7BCIP溶液【配制方法】把0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐（BCIP）溶解于10ml 100%的二甲基甲酰胺中，保存于482BES缓冲盐溶液【配制方法】用总体积90ml的蒸馏水溶解1.07g盐溶液BESN，N-双（2-羟乙基）-2-氨基乙磺酸、1.6g NaCl和0.027g Na2HPO4，室温下用HCl调节该溶液的pH值至6.96、然后加入蒸馏水定容至100ml，用0.22m滤器过滤除菌，分装成小份，保存于-20。91mol/L CaCl2溶液【配制方法】在200ml蒸馏水中溶解54g CaCl2?6H2O，用0.22m滤器过滤除菌，分装成10ml小份贮存于-20。【注意】制备感受态细胞时，取出一小份解冻并用蒸馏水稀释至100ml，用Nalgene滤器（0.45m孔径）过滤除菌，然后骤冷至0。102.5mol/L CaCl2溶液【配制方法】在20ml蒸馏水中溶解13.5g CaCl2?6H2O，用0.22m滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20。111mol/L二硫苏糖醇（DTT）溶液【配制方法】用20ml 0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT，过滤除菌后分装成1ml小份贮存于-20。【注意】DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理。12脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液【配制方法】把每一种dNTP溶解于水至浓度各为100mmol/L左右，用微量移液器吸取0.05mol/l Tris碱分别调节每一dNTP溶液的pH值7.0（用pH试纸检测），把中和后的每种dNTP溶液各取一份作适当稀释，在给出的波长下读取光密度计算出每种dNTP的实际浓度，然后用水稀释成终浓度为50mmol/L的dNTP，分装成小份贮存于-70。130.5mol/l EDTA(pH8.0)溶液【配制方法】在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na?2H2O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0（约需20g NaOH颗粒）然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。【注意】EDTA二钠盐需加入NaOH将溶液的pH值调至接近8.0，才能完全溶解。14溴化乙锭（10mg/ml溶液）【配制方法】在100ml水中加入1g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。【注意】小心：溴化乙锭是强诱变剂并有中度毒性，使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套，称量染料时要戴面罩。152HEPES缓冲盐溶液【配制方法】用总量为90ml的蒸馏水溶解1.6g NaCl、0.074g KCl、0.027g Na2PO4?2H2O、0.2g葡聚糖和1gHEPES，用0.5mol/l NaOH调节pH值至7.05，再用蒸馏水定容至100ml。用0.22m滤器过滤除菌，分装成5ml小份，贮存于-20。16IPTG溶液【配制方法】IPTG为异丙基硫代-D-半乳糖苷（分子量为238.3），在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22m滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20。171mol/L乙酸镁溶液【配制方法】在800ml水中溶解214.46g四水乙酸镁，用水定容至1L过滤除菌。181mol/L MgCl2溶液【配制方法】在800ml水中溶解203.4g MgCl2?6H2O，用水定容至1L，分装成小份并高压灭菌备用。【注意】MgCl2极易潮解，应选购小瓶（如100g）试剂，启用新瓶后勿长期存放。19-巯基乙醇（BME）溶液【配制方法】一般得到的是14.4mol/L溶液，应装在棕色瓶中保存于4。【注意】BME或含有BME的溶液不能高压处理。20NBT溶液【配制方法】把0.5g氯化氮蓝四唑溶解于10ml 70%的二甲基甲酰胺中，保存于4。21酚/氯仿溶液【配制方法】把酚和氯仿等体积混合后用0.1mol/L Tris?HCl(pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆盖等体积的0.01mol/l Tris?HCl(pH7.6)液层，保存于4。【注意】酚腐蚀性很强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套及防护镜，穿防护服。所有操作均应在化学通风橱中进行。与酚接触过的部位皮肤应用大量的水清洗，并用肥皂和水洗涤，忌用乙醇。2210mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液【配制方法】用异丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml（10mmol/L），分装成小份贮存于-20。如有必要可配成浓度高达17.4mg/ml的贮存液（100mmol/L）。【注意】PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。PMSF在水溶液中不稳定。应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中。PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH值的升高而加快，且25的失活速率高于4。pH值为8.0时，20mmol/l PMSF水溶液的半寿期大约为85min，这表明将PMSF溶液调节为碱性（pH8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。23磷酸盐缓冲溶液（PBS）溶液【配制方法】在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,用HCl调节溶液的pH值至7.4加水定容至1L，在15lbf/in2(1034105Pa)高压下蒸气灭菌20min。保存于室温。241mol/L乙酸钾（pH7.5）溶液【配制方法】将9.82g乙酸钾溶解于90ml纯水中，用2mol/L乙酸调节pH值至7.5后加入纯水定容到1L，保存于-20。25乙酸钾溶液（用于碱裂解）【配制方法】在60ml 5mol/L乙酸钾溶液中加入11.5ml冰乙酸和28.5ml水，即成钾浓度为3mol/L而乙酸根浓度为5mol/L的溶液。263mol/L乙酸钠（pH5.2和pH7.0）溶液【配制方法】在80ml水中溶解408.1g三水乙酸钠，用冰乙酸调节pH值至5.2或用稀乙酸调节pH值至7.0，加水定容到1L，分装后高压灭菌。275mol/L NaCl溶液【配制方法】在800ml水中溶解292.2g NaCl加水定容至1L，分装后高压灭菌。2810%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液【配制方法】在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分装备用。【注意】SDS的微细晶粒易扩散，因此称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的SDS，10%SDS溶液无须灭菌。2920SSC溶液【配制方法】在800ml水中溶解175.3g NaCl和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/l NaOH溶液调节pH值至7.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。3020SSPE溶液【配制方法】在800ml水中溶解17.5g NaCl、27.6g NaH2PO4?H2O和7.4g EDTA，用NaOH溶液调节pH值至7.4（约需6.5ml 10ml/L NaOH），加水定容至1L，分装后高压灭菌。31100%三氯乙酸溶液【配制方法】在装有500g TCA的瓶中加入227ml水，形成的溶液含有100%（M/V）TCA。321mol/L Tris溶液【配制方法】在800ml水中溶解121.91g Tris碱，加入浓HCl调节pH值至所需值。应使溶液冷至室温后方可最后调定pH值，加水定容至1L，分装后高压灭菌。【注意】如1mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃并置备质量更好的Tris。尽管多种类型的电极均不能准确测量Tris溶液的pH值，但仍可向大多数厂商购得合适的电极。Tris溶液的pH值因温度而异，温度每升高1，pH值大约降低0.03个单位。例如：0.05mol/L的溶液在5、25、和37时的pH值分别为9.5、8.9和8.6。33Tris缓冲盐溶液（TBS）（25mmol/l Tris）【配制方法】在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl和3g Tris碱，加入0.015g酚并用HCl调至pH值至7.4，用蒸馏水定容至1L，分装后在151bf/in2(1.034105Pa)高压下蒸汽灭菌20min，于室温保存。34X-gal溶液【配制方法】X-gal为5-溴-4-氯-3-吲哚-D半乳糖苷。用二基甲酰胺溶解X-gal配制成的20mg/ml的贮存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，装有X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏，并应贮存于-20。X-gal溶液无须过滤除菌。 配制：乙二胺四乙酸二钠盐滴定液(0.1mol/L)称取乙二胺四乙酸二钠盐40g，加热溶于1000ml水中，冷却，摇匀。乙二胺四乙酸二钠盐滴定液(0.05mol/L)称取乙二胺四乙酸二钠盐20g，加热溶于1000ml水中，冷却，摇匀。乙二胺四乙酸二钠盐滴定液(0.02mol/L)称取乙二胺四乙酸二钠盐8g，加热溶于1000ml水中，冷却，摇匀。标定：标定：0.1mol/L乙二胺四乙酸二钠盐溶液，取于约800灼烧至恒重的基准氧化锌0.25g0.0001g，用少量水湿润，加2ml稀盐酸20%使其溶解，加水100ml，用10%氨水调至PH=78，加10ml氨氯化铵（pH=10）及铬黑T指示剂，用配制好的乙二胺四乙酸二钠滴定液(0.1mol/L)滴定至溶液由紫色变为纯蓝色。同时做空白。C（EDTA）乙二胺四乙酸二钠盐标准溶液量浓度 mol/LV1乙二胺四乙酸二钠盐标准溶液用量 mlV2乙二胺四乙酸二钠盐标准溶液用量 ml0.08138与1.00ml乙二胺四乙酸二钠盐标准溶液1.000mol/L相当的以克表示的氧化锌的质量1.几种常用溶液浓度的表示法（1）质量百分比浓度：用溶质的质量占全部溶液质量的百分比来表示的浓度。简称百分浓度。（2）体积百分比浓度：用溶质的质量占溶剂体积的百分比来表示的浓度。在工农业生产中常用这种浓度。（3）体积比浓度：液体试剂相互混和或液体试剂用水稀释时常用此法。例如，13酒精溶液指的是1体积的酒精和3体积的蒸馏水混和而成的酒精水溶液，13中的前一个数字指的是溶质的体积数，后一个数字指的是溶剂的体积数。（4）物质的量浓度：用1升溶液里含有溶质的量来表示的溶液浓度。目前习惯称摩尔浓度，用M表示。（5）当量浓度：用每升溶液里所含溶质的克当量数表示的浓度。通常用N表示。2.常用酸碱溶液的配制表4-12常用酸碱溶液的配制3.常用盐溶液的配制表4-13常用盐溶液的配制续表常用溶液的配制10.5mol/l EDTA(pH8.0)溶液【配制方法】在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na?2H2O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0（约需20g NaOH颗粒）然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。【注意】EDTA二钠盐需加入NaOH将溶液的pH值调至接近8.0，才能完全溶解。0. 1mol/l EDTA(pH8.0)溶液【配制方法】在800ml水中加入37.224g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na?2H2O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用2当量NaOH调节溶液的pH值至8.0然后定容至1L。使用时稀释一百倍变成1mMol/l EDTA工作液。PH值调至82磷酸盐缓冲溶液（PBS）溶液【配制方法】在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,用HCl调节溶液的pH值至7.4加水定容至1L，在15lbf/in2(1034105Pa)高压下蒸气灭菌20min。保存于室温。3Tris缓冲盐溶液（TBS）（25mmol/l Tris）【配制方法】在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl和3g Tris碱，加入0.015g酚并用HCl调至pH值至7.4，用蒸馏水定容至1L，分装后在151bf/in2(1.034105Pa)高压下蒸汽灭菌20min，于室温保存。Tris缓冲盐溶液（TBS）（50mmol/l Tris PH7.6）Tris缓冲盐溶液（TBS）（50mmol/l Tris）【配制方法】称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）6.057g，加少许双蒸水溶解后加1HCL42ml,Nacl 8.5g,最后加双蒸水至1000ml,用1N HCL或NAOH调至7.6,充分摇匀,4保存4当量当量表示元素或化合物相互作用时的重量比的数值1mol/L的H2SO4,如果换成当量浓度就应该是2NH2SO4，大概的意思就是1mol的H2SO4会有2mol的氢离子，类似的1mol/L的HCL就是1N，1mol/L的NAOH就是1N，1mol/L的CA(OH)2就是2N,这是酸碱的。如果是氧化物或是还原物就看能得失的电子数，比如说1mol/L的K2Cr2O7的当量浓度就应该是6N,1mol/L的KMnO4的当量浓度是5N。如果是盐类，就看能与酸或碱结合所要的H+或OH-数量，比如说NA2CO3的就是2，NAHCO3是11当量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。1当量NaOH配制：称取NaOH 4g 配成100ml溶液。1当量硫酸溶液：量取分析纯硫酸（比重1.83）28毫升，慢慢注入500 毫升水中，冷却后稀释到1升。0.1当量硫酸溶液：量取分析纯硫酸2.8毫升，溶解于500毫升水中，冷却后稀释到1升。配制培养基有两种方法可以选择，一是购买培养基中所有化学药品，按照需要自己配制；二是购买商品的混合好的培养基基本成分粉剂，如MS、B5等。自己配制可以节约费用，但浪费时间、人力、且有时由于药品的质量问题，给实验带来麻烦。就目前国内的情况看，大部分还是自己配制。为了方便起见，现以MS培养基为例介绍配置培养基的主要过程。1、配制几种母液（1）配制MS大量元素母液一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。分别称取NH4NO3 165g KH2PO4 17gKNO3 190g CaCl22H2O 44gMgSO47H2O 37g各自配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。（2）配制MS微量元素母液一般将微量元素配制成100倍母液。依次称取KI 0.083g Na2MoO42H2O 0.025gH3BO3 0.62g CuSO45H2O 0.0025gMnSO4H2O 1.69g CoCl26H2O 0.0025gZnSO47H2O 0.86g配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。CuSO45H2O和CoCl26H2O 由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。分别称取CuSO45H2O 0.05g CoCl26H2O 0.05g各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。（3）配制MS有机母液一般配制成100倍MS有机母液。依次称取肌醇 10g 盐酸硫胺素（VB1） 0.01g烟酸 0.05g 甘氨酸 0.2g盐酸吡哆醇（VB6） 0.05g配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。（4）配制MS铁盐母液一般配制成100倍MS铁盐母液。依次称取EDTA二钠 3.73g FeSO47H2O 2.78g配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。所以MS母液有5种大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有机母液和MS铁盐母液，共8种母液。激素母液的配制各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解，然后再加蒸馏水定容。一般取100mg配成100ml母液。2、配制培养基以配置1L MS培养基为例，按顺序进行如下操作：（1）先在烧杯中放入一些蒸馏水。（2）分别取上面八种母液10ml倒入。（3）一般称取30g蔗糖倒入，搅拌溶解。（4）加蒸馏水用量筒定溶至1L。（5）按设计好的方案添加各种激素，由于激素的用量很小，而且激素对组培植物的生长至关重要。所以有条件的话最好用微量可调移液器吸取，减少误差。（6）用精密试纸或酸度计调整PH至5.7-5.8。（有条件的话使用酸度计，比较精确）可配1当量的HCL和1当量的NaOH用来调溶液PH值。1当量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。1当量NaOH配制：称取NaOH 4g 配成100ml溶液。（7）称取5g左右琼脂粉（质量好的琼脂粉),倒入上面配好的溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化。（8）稍微冷却后，分装入培养容器中。无盖的培养容器要用封口膜或牛皮纸封口，用橡皮筋或绳子扎紧。（9）放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右。（10）灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固。PCR反应条件的选择2008年09月23日 星期二 18:06PCR反应条件的选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因长度为100300bp时可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性。变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，9394lmin足以使模板DNA变性，若低于93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。退火复性温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值解链温度=4G+C2A+T复性温度=Tm值-510在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：7080 150核苷酸/S/酶分子70 60核苷酸/S/酶分子55 24核苷酸/S/酶分子高于90时， DNA合成几乎不能进行。PCR反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。34kb的靶序列需34min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。循环次数循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在3040次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。引物的稀释和使用2008年09月13日 星期六 09:361 Oligo DNA是以OD260单位来计算的，这是指在1ml体积1cm光程标准比色皿中，260nm波长下吸光度为1A260的Oligo溶液定义为1 OD260单位，根据此定义，1 OD260单位相当于33g的Oligo DNA，您可以根据此数据和您的Oligo DNA分子量，计算得到摩尔数以计算不同摩尔浓度的溶液。2 引物序列的分子量计算公式如下：MW=（A碱基数312）+（C碱基数288）+（G碱基数328）+（T碱基数303）-61例如：引物TGGGCGGCGGTTGGTGTTACG A=1 C=3 G=11 T=6MW=（1312）+（3328）+（6303）-61=65413 Oligo DNA的分子量也可以用以下近似方法计算：Oligo DNA中的每个脱氧核苷酸碱基的平均分子量近似为324.5，则一条Oligo DNA的分子量=碱基数324.5。例：您得到一管标为5 OD260的20 mer Oligo DNA分子量=20324.5=6490质量数=533=165g摩尔数=165/6490=0.025mol=25nmol若加灭菌双蒸水400l溶解，则浓度为25nmol/400l=62.5M4 装有引物的eppendorf管一般保存于-20，临用前稀释。5 由于Oligo DNA呈很轻的干膜状附在管壁上，打开时极易散失，所以打开管子前请先离心10,000rpm，1min，然后再慢慢打开管盖。6 在装有引物的eppendorf管内加入100-500l双蒸水，盖上管盖，充分上下振荡5-10分钟，再次离心10,000rpm，1min。7 计算原引物管primer的浓度（必要时测OD260核对厂家提供引物量是否正确）。8 计算并将应用primer稀释为10pmol/l。9 标明原引物管、应用引物管、稀释方法，置-20保存。如何查找一个基因的启动子序列2008年10月17日 星期五 11:01如何查找一个基因的启动子序列关键词： 基因 启动子序列 软件 定义：启动子是参与特定基因转录及其调控的DNA序列。包含核心启动子区域和调控区域。核心启动子区域产生基础水平的转录，调控区域能够对不同的环境条件作出应答，对基因的表达水平做出相应的调节。 区域：启动子的范围非常大，可以包含转录起始位点上游2000bp，有些特定基因的转录区内部也存在着转录因子的结合位点，因此也属于启动子范围。这项搜寻要从UCSC基因组浏览器开始，网址为/。以编码pendrin (PDS)的基因为例来说明上述问题。PDS与耳蜗的异常发育、感觉神经性听力下降以及弥散性甲状腺增大（甲状腺肿）有关。进入UCSC的主页后，在Organism的下拉菜单中选择Human，然后点击Browser。使用者现在到了人类基因组浏览器入口。本例的搜寻很简单：在assembly的下拉菜单中选择Dec. 2001，在position框中键入pendrin，然后点击Submit。返回的页面结果显示一个已知的基因和两个mRNA序列。继续点击mRNA序列的登录号AF030880，出现包含这个mRNA区域的图解概要。为了获得这个区域更清晰的图像，点击紧靠zoom out的1.5X按钮。最后点击页面中部的reset all按钮，使各个路径的设置恢复默认状态。然而，对于本例的搜寻目的来说，默认设置不是理想的设置。按照视图利用页面底部的Track Controls按纽，将一些路径设置为hide模式（即不显示），其他设置为dense模式（所有资料密集在一条直线上）；另一些路径设置为full模式（每个特征有一个分开的线条，最多达300）。在考虑这些路径内究竟存在那些资料之前，对这些路径的内容和表现做一个简要的讨论是必要的，许多这些讨论是由外界提供给UCSC的。下面是对基因预测方法的更进一步讨论，这些信息也可以在其他地方找到。对于Known Genes（已知基因）和预测的基因路径来说，一般的惯例是以一个高的垂直线或块状表示每个编码外显子，以短的垂直线或块状表示5端和3端非翻译区。起连接作用的内含子以非常细的线条表示。翻译的方向由沿着细线的箭头指示。Known Genes来自LocusLink内的mRNA参照序列，已经利用BLAT程序将这些序列与基因组序列进行比对排列。Acembly Gene Predictions With Alt-splicing路径是利用Acembly程序将人类mRNA和EST序列数据与人类基因组序列进行比对排列而来的。Acembly程序试图找到mRNA与基因组序列的最好的比对排列以及判断选择性剪接模型。假如有多于1个的基因模型具有统计学意义，则它们都全部显示出来。有关Acembly的更多信息可以在NCBI的网站找到（/IEB/Research/Acembly/）。Ensembl Gene Predictions路径由Ensembl提供。Ensembl基因通过许多方法来预测，包括与已知mRNA和蛋白质进行同源性比较，ab initio基因预测使用GENSCAN和基因预测HMMs。 http:/www.ebi.ac.uk/ensembl/Fgenesh+ Gene Predictions路径通过寻找基因的结构特征来预测基因内部的外显子，例如剪接位点的给位和受位的结构特征，利用一种动态的程序算法推定编码区域和推定外显子5端和3端的内含子区域；这个方法也考虑到蛋白质相似性的资料。Genscan Gene Predictions路径由GENSCAN方法衍生而来，通过这个方法，可以确定内含子、外显子、启动子区域和poly(A)信号。此时，这个方法并不期望查询的序列只出现1个基因，因此可以对部分基因或被基因之间的DNA分隔的多个基因进行准确的预测。Human mRNAs from Genbank路径显示基因库的人类mRNAs与基因组序列的比对排列。Spliced ESTs和Human EST路径显示来自GenBank的ESTs序列与基因组的序列对齐比较。由于ESTs通常代表了转录基因的片断，一个EST很有可能对应于某个外显子区。最后，Repeating Elements by RepeatMasker这个路径显示的是重复元件，例如散在的或长或短的核元素(SINEs和LINEs)，长末端重复序列(LTRs)和低复杂性区域(/cgi-bin/RepeatMasker)。一般来说，在将基因预测方法应用于核苷酸序列之前，需要去掉或掩饰这些成分。回到视图显示的例子，可以看到大多数路径返回了几乎同样的基因预测结果。作为一个规则，通过多种方法预测的外显子提高了预测的正确率而不会出现“假阳性”结果。多数方法显示3端非翻译区，以左侧大而短的块状表示。Acembly路径显示除了全长序列产物（如这个部分第3条线所示）之外还有3个可能的选择性剪接，其它大多数路径显示与此预测结果相符。Genscan路径从左、右方向往远处延伸：GENSCAN可以被用于预测多个基因。尽管这些图解概要很有用，然而研究者更需要与这些垂直线或块状相对应的序列。以此为例，用Fgenesh+预测作为获得原始序列数据的基础，但不管选择哪个路径其步骤都是一样的。点击标有Fgenesh+ Gene Predictions的路径，出现的是一个描述预测的概要页面。序列的区域与pendrin基因相似（从这个例子一开始就已经知道了）。给出了序列的大小及序列开始和结束的预测，并显示预测是以负链为基础的。想要获得序列，点击Genomic Sequence。使用者将被带到一个标题为Get Genomic Sequence Near Gene的查询页面，在这个页面上，可以获得转录物、编码区、启动子或转录物加启动子的序列。点击Transcript返回的页面显示完整的转录子，外显子以大写字母表示。点击Coding Region Only得到的是编码区,外显子以大写字母表示。点击Transcript + Promoter，返回的页面显示的是在上述选择Transcript所获序列的5端添加了启动子序列，以大写字母表示外显子。启动子的长度显示在文本框内。点击Promoter返回的页面正好是启动子区外源DNA和质粒载体的连接反应2008年07月03日 星期四 09:59外源片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链磷酸和相邻的3羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5磷酸，可生成个新的磷酸二酯链。但如果质粒已去磷酸化，则吸能形成个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的磷酸和羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌连接酶和噬菌体连接酶。实际上在有克隆用途中，噬菌体连接酶都是首选的用酶。这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端片段连接起来。一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的末端的浓度决定。不论末端位于同一分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体。在瓜作用的底物。如果反应中浓度低，则配对的两个末端同一分子的机会较大（因为分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同分子的末端的概率）。这倦，在浓度低时，质粒重新环化将卓有成效。如果连接反应中浓度有所增高，则在分子内连接反应发生以前，某一个分子的末端碰到另一分子末端的可能性也有所增大。因此在浓度高时，连接反的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。Dugaiczyk等(1975;同时参见Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第、期合刊）从理论上探讨了浓度对连接产物性质的影响。简而言之，环化的连接产物与多联体连接产物的比取决于两个参数：j和i。j是分子的一个末端在同一分子的另一末端附近的有效浓度，j的数值是根据如下一种假设作出的：沉吟液中的呈随机卷曲。这样，j与分子的长度成反比（因为越长，某一给定分子的两末端的越不可能相互作用），因此j对给定长度的分子来说是一个常数，与深度无关。j3/(3lb0)3/2其中l是长度，以cm计，b是随机卷曲的区段的长度。b的值以缓冲液的离子强度为转移，而后者可影响的刚度。i是溶液中所有互补末端的深度的测量值，对于具有自身互补粘端的双链dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml这里o是阿佛伽德罗常数，是的摩尔浓度（单位：mol/L)。理论上，当j=i时，给定分子的一个末端与同一分子的另一末端，以及与不同分子的末端相接触的可能性相等。因而在这样的条件下，在反应的初始阶段中，环状分子与多联体分子的生成速率相等。而当ji时，有利于重新环化；当ij，则有利于产生多联体。图1.9显示了区段的大小与连接反应混合物中j:i之比分别为0.5、1、2和5时所需浓度之间关系（ugaiczyk等，1985）。 现在考虑如下的连接反应混合物：其中除线状质粒之外，还含有带匹配末端的外源片段。对于一个给定的连接混合物而言，产生单体环状重组基因组的效率不仅受反应中末端的绝对浓度影响， 而且还受质粒和外源末端的相对浓度的影响。当i是j的倍（即末端的绝对浓度足以满足分子间连接的要求，而又不致引起大量寡聚体分子的形成时）外源末端浓度的倍时，有效重组体的产量可达到最大。这些条什下，连接反应终产物的大约40都是由单体质粒与外源所形成的嵌合体。当连接混合物中线瘃质粒的量恒定（j:i=3）而带匹配末端的外源的量递增时，这种嵌合体在连接反应之末的理论产量。涉及带粘端的线状磷酸化质粒的连接反应应包含：）足量的载体，以满足j:i1和j:i3。对一个职pUC18一般大小的质粒，这意味着连接反应中应含有载体为20-60g/ml。）未端浓度等于或稍高于载体的外源，如外源浓度比载体低得多，在效连接产物的数量会很低，这样就很难别小部分带重组抽粒的转化菌落。这种情况下，可考虑采用一些步骤来减少带非重组质粒的背景菌落。如用磷酸酶处理线状质粒或发迹克隆策略以便通过定向克隆的方法构建重组质粒。 (二）粘端连接）用适当的限制酶消化质粒和外源。如有必要，可用凝胶电泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒。通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化，然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。）按如下所述设立连接反应混合物：a将0.1l载体转移到无菌微量离心管中，加等摩尔量的外源。b加水至7.5l，于45加温分钟以使重新退炎的粘端解链，将混合物冷却到。c加入：10xT4噬菌体连接酶缓冲液 l噬菌体连接酶 0.1Weiss单位mmol/L ATP 1l于16温育小时10xT4噬菌体连接酶缓冲液200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)50mmol/K MgCl250mmol/L二硫苏糖醇500g/ml牛血清白蛋白（组分.Sigma产品）（可用可不用）该缓训液应分装成小份，贮存于20。另外，再设立两个对照反应，其中含有（）只有质粒载体；（）只有外源片段。如果外源量不足，每个连接反应可用50-100ng质粒，并尽可能多加外源，同时保持连接反应体积不超过10l。可用至少种不同方法来测定噬菌体连接酶的活性。大多数制造厂商（除New England Biolabs公司外）现在都用Weiss等，1968)对该酶进行标化。个Weiss单位是指在37下20分钏内催化mmol32P从焦磷酸根置换