青枯雷尔氏菌致病力分化的细菌色谱表征.doc

分类号：S435 单位代码：10389 密 级： 学 号：100820047 福州大学福州大学硕硕士学位士学位论论文文 青枯雷尔氏菌致病力分化的细菌色谱表征 学 科 门 类：工学 一级学科名称：生物工程 二级学科名称：发酵工程 研 究 方 向：生物农药 研 究 生：余谦 指 导 教 师：刘波 研究员 郑雪芳 副研究员 完 成 时 间：二 O 一三年一月 一一 遵守学术行为规范承诺遵守学术行为规范承诺 本人已熟知并愿意自觉遵守福州大学研究生和导师学术行为规范暂 行规定的所有内容，承诺所提交的毕业和学位论文是终稿，不存在学术 不端行为，且论文的纸质版与电子版内容完全一致。 二二 独创性声明独创性声明 本人声明所提交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中 不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得福州大学或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本人完全 意识到本声明的法律结果由本人承担。 三三 关于论文使用授权的说明关于论文使用授权的说明 本人完全了解福州大学有关保留使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全 部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 （保密的论 文在解密后应遵守此规定） 本学位论文属于（必须在以下相应方框内打本学位论文属于（必须在以下相应方框内打“”“” ，否则一律按，否则一律按“非保非保 密论文密论文”处理）：处理）： 1、保密论文： 本学位论文属于保密，在 年解密后适用本授权 书。 2、非保密论文：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 研究生本人签名： 签字日期：20 年 月 日 Abstract II 研究生导师签名： 签字日期：20 年 月 日 中文摘要中文摘要 本论文利用高效液相离子交换色谱体系，研究了世界上分布最广、危害最重且最 难防治的植物致病菌青枯雷尔氏菌的色谱行为。通过对不同来源地菌株的色谱分析， 研究了不同致病力不同地域不同寄主的青枯雷尔氏菌的色谱行为，并且探究了 Tn-5 青 枯雷尔氏菌在番茄内的定殖能力、生物防效以及生物防效和色谱行为之间的联系，并 且建立了青枯雷尔氏菌的特征色谱图库。主要研究内容及结果如下： 1 优化了青枯雷尔氏菌的色谱分离及表征的条件。通过优化，得到最佳的色谱条 件。在室温下，通过色谱的表征，青枯雷尔氏菌表现出不同的色谱形态。 2 通过对不同致病力的菌株以及 FJAT-91 和 FJAT-1458 的混合菌体进行了色谱表征， 得到了不同致病力的青枯雷尔氏菌的特征谱图。通过对特征谱图的分析表明：不同致 病力的菌株的特征峰在峰型以及保留时间上有差别，致病力越强的菌株，其特征峰的 保留时间越长；细菌色谱能够讲混合菌株分离开。 3 对 35 株弱致病性的 Tn-5 青枯雷尔氏菌进行了色谱表征。根据其特征峰的个数， 将这 35 株菌分为 3 类。第 1 类，在 1min 出现单一的特征峰；第 2 类，在 1min 和 8min 都出现特征峰；第 3 类，在 1min、8min 和 17min 都出现特征峰。 4 对分离自不同地域不同寄主的青枯雷尔氏菌进行了色谱表征。通过对这 4 种寄主 的青枯雷尔氏菌进行色谱表征，也得到了 3 种类型的特征谱图。结果表明青枯雷尔氏 菌的色谱形态和寄主以及地域的相关性不大，与致病力有关。 5 对 Tn-5 转座子插入的青枯雷尔氏菌的定殖能力与生物防效进行了研究，并且构 建了细菌色谱效价体系。研究表明，生物防效较好的菌株，其定殖能力就较强，而且 其色谱形态大多表现出第 1 类形态；通过相关性分析得出色谱效价（X1）和生防效果 (X2)之间呈正相关的关系，其相关系数为 0.60。 实验表明利用高效液相离子交换色谱法对青枯雷尔氏菌进行表征，可对青枯雷尔 氏菌进行分类，并且研究了色谱行为与致病力、寄主以及地域之间的关系。这种研究 方法将为阐明青枯菌的多态性及其在传代培养过程中致病性逐渐减弱的内在机理，并 最终研制出特效的青枯菌抗菌剂奠定基础。 关键词：青枯雷尔氏菌， 高效液相色谱，色谱分析，植物疫苗，定殖 II Abstract Ralstonia solanacearum, one of the most widely world distributed and economically important plant pathogen, has been studied by the ion exchange high performance liquid chromatography (IE- HPLC). By chromatographic analysis of strains from different sources, the study on pathogenicity of R. solanacearum strains in different parts of plants in different host showed the different chromatographic behavior, based on which some of the strains such as Tn-5 inserted R. solanacearum strains explored the colonization ability and biological control effect in tomato bacterial wilt disease. The relationship between biological efficacy and chromatographic behavior was to be studied to establish the titer index for R. solanacearums chromatography gallery. The results showed as follows: 1 The chromatographic conditions of R. solanacearum are optimizationed. Through optimization, the best chromatography condition was obtained. At the room temperature, characterizated by chromatographic, R. solanacearum strains showing different chromatographic patterns. 2 Two different pathogenicity strains FJAT-91 and FJAT-1458 are characterization by chromatographic as models to distinguish different virulence of R. solanacearum strains by the characteristics. The analysis of characteristic spectra indicated that the different pathogenicity strains had different peaks and retention time in the chromatography. The stronger the strain virulence was, the longer the peak was. 3 35 of the Tn-5-inserted R. solanacearum strains with the low pathogenicity were detected to get the chromatographic characterization. According to the characteristics of their peak numbers, these 35 strains of bacteria were divided into 3 categories. The first group, appeared a single characteristic peaks in 1min of retention time, the second goup, two peaks in 1min and 8min of retention time, the third class, three peaks in 1min, 8min and 17min of retention time. 4 R. solanacearum strains were, Isolated from different hosts, made for the chromatographic characterization. R. solanacearum strains got from the 4 host for the chromatographic characterization tested in 3 types of characteristic spectra. The results showed that R. solanacearum chromatographic patterns could be distinguished by bacteria and host, both with less relevant, but associated with pathogenicity. (自己修改，没有一句是对的， ， ， ， ，) 5 The colonization ability and biological control with the Tn-5 inserted R. solanacearum strains. The studies shown that bio-control effect of better strains of their colonization on a strong and much of its chromatographic patterns showed the 1th class form. Through correlation analysis，the relationship between chromatography potency (X1),and biological control (X2) were positively related，the correlation coefficient is 0.60. Abstract The study shown that the use of ion-exchange high performance liquid phase chromatography to characterization of R. solanacearum strains, R. solanacearum strains can be classified, and the study of chromatographic behavior and relationship between pathogenicity and host as well as geographical. The results are very important for us to elucidate the multi-states of R.solanacearum and the mechanism of R.solanacearums pathogenicity mutation. Key words: R. solanacearum, High performance liquid chromatography, Chromatographic analysis, Plant vaccine, Colonization 目录 IV 目目 录录 中文摘要.I ABSTRACT.II 第一章 绪 论2 1 前言.2 2 青枯雷尔氏菌的致病机理以及致病力分化 2 3 高效液相色谱在细菌上的应用 4 3.1 高效液相色谱在青枯雷尔氏菌上的应用.5 4 青枯病的防治研究进展 6 4.1 化学防治.6 4.2 生物防治.6 5 本文研究目的和意义 8 第二章 青枯雷尔氏菌致病力分化9 1 前言 9 2 材料及方法 9 2.1 材料.9 2.2 方法.9 3 结果与分析 10 3.1 弱化指数的测定.10 3.1.1 Tn-5 转座子插入菌株的弱化指数10 3.1.2 自然分离菌株的弱化指数10 4 讨论 13 第三章 青枯雷尔氏菌细菌色谱条件确立14 1 前言 14 2 材料及方法 14 2.1 材料.14 2.2 方法.14 2.2.1 色谱原理14 2.2.2 高效液相色谱条件及方法探究15 2.2.2.1 青枯雷尔氏菌的培养.15 2.2.2.2 缓冲液对青枯雷尔氏菌活性的影响.15 2.2.2.3 样品前处理.15 2.2.2.4 缓冲体系的确定.15 2.2.2.5 进液量的优化.16 2.2.3 色谱条件的确立16 2.2.3.1 色谱系统的前处理.16 2.2.3.2 色谱体系及方法.16 3 结果与分析16 3.1 色谱环境的分析.16 目录 3.2 缓冲液对青枯雷尔氏菌活力的影响.17 3.3 上样样品的前处理.17 3.4 色谱条件的确立.18 3.4.1 缓冲液 pH 的确定.19 3.4.2 进液量的选择20 4 讨论 22 第四章 青枯雷尔氏菌致病性分化细菌色谱表征及特征图谱的建立24 1 前言 24 2 材料与方法 24 2.1 材料.24 2.2 青枯雷尔氏菌的色谱表征.24 2.2.1 不同致病力的青枯雷尔氏菌的色谱表征24 2.2.2 Tn-5 转座子插入系列青枯雷尔氏菌的色谱表征25 2.2.3 不同寄主的青枯雷尔氏菌的色谱表征25 3 结果与分析 27 3.1 不同致病力青枯雷尔氏菌细菌色谱表征.27 3.2 青枯雷尔氏菌 FJAT-91 和 FJAT-1458 的色谱表征28 3.3 Tn-5 转座子插入青枯雷尔氏菌的色谱表征及特征色谱图库的建立.29 3.4 不同寄主中青枯雷尔氏菌的色谱表征及特征色谱图库的建立.33 3.4.1 花生植株中青枯雷尔氏菌的色谱表征及特征色谱图库的建立33 3.4.2 辣椒植株中青枯雷尔氏菌的细菌色谱表征及特征色谱图库的建立35 3.4.3 茄子植株中青枯雷尔氏菌的色谱表征及特征色谱图库的建立37 3.4.4 番茄植株中青枯雷尔氏菌的色谱表征及特征色谱图库的建立39 4 讨论 41 第五章 TN-5 插入构建的青枯雷尔氏菌无致病力菌株的定殖及生物防效 43 1 前言.43 2 材料与方法 43 2.1 材料.43 2.2 方法.43 2.2.1 番茄植株的培养.43 2.2.2 青枯雷尔氏菌菌悬液的制备.43 2.2.3 转座子 Tn-5 插入青枯雷尔氏菌在番茄植株内定殖数量44 2.2.4 植株体内青枯雷尔氏菌的分离.44 2.2.5 转座子 Tn-5 插入青枯雷尔氏菌的灌根处理44 2.2.6 转座子 Tn-5 插入青枯雷尔氏菌的防效评价44 2.2.7 无致病力青枯雷尔氏菌色谱效价的构建44 3 结果与分析 45 3.1 转座子 Tn-5 插入青枯雷尔氏菌在番茄植株内定殖数量.45 3.2 转座子 Tn-5 插入青枯雷尔氏菌的生物防效实验.46 3.3 无致病力青枯雷尔氏菌植物疫苗色谱效价与病害防效的相互关系48 目录 VI 4 讨论 50 第五章 结论和展望52 1 结论.52 2 展望.53 参考文献54 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果60 致 谢62 个人简历63 青枯雷尔氏菌致病力分化的细菌色谱研究 2 第一章 绪 论 1 1 前言前言 青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacecrum)，简称青枯菌。是一种革兰氏阴性植物的病原 菌，是世界上危害最大、分布最广、造成损失最严重的植物病害之一(Hayward A C,EI Nashaar H M,Nydegger U,1990)。至今尚没有有效的化学农药和其他防治办法。因此青枯病 有着植物的“癌症”之称。植物青枯菌可侵染40多个科200多种植物，仅次于农杆菌 （Araud-Razou I，Vasse J，Montrozier H，1998），是番茄、马铃薯、花生、甘薯、烟草、 辣椒、茄子、生姜、草莓、香蕉以及一些贵重药材和花卉植物许多植物生产的重要限 制因素，世界各地均有分布（杨柳，兰涛，巫升鑫，陈顺辉,吴为人，2011） 。 2 2 青枯雷尔氏菌的致病机理以及致病力分化青枯雷尔氏菌的致病机理以及致病力分化 通过研究发现，青枯雷尔氏菌是从植株的根部以及茎部的受伤部位侵入到植株体 内，从而引发植株发病。但是在自然的条件下，青枯雷尔氏菌也能从没有受伤的植株 的次生根的根冠侵入。植物生长时在次生根的根冠和主根的表皮间形成鞘，青枯雷尔 氏菌能穿过这层鞘，侵入到皮层细胞的间隙生长，从而破坏植物细胞间的中胶层，使 细胞壁发生分离，引起细胞壁变形，形成空腔，继而侵染细胞，木质部薄壁组织使导 管附近的小细胞受刺激形成侵填体，并移侵入到填体，引起填体破裂后，进入导管， 并在导管内大量繁殖和快速扩张，从而引起植株萎蔫死亡（Husain A，Kelman，1958） 。 植物病理学的研究表明：青枯雷尔氏菌侵入到植株体内后，在皮层细胞的间隙定殖， 在生长时，产生大量的胞外多糖，从而引起植株体内水分运输的障碍，造成导管的堵 塞，造成植株的枯萎。植株在感染青枯病后，先是植株的顶端叶片萎蔫下垂，然后继 而引起植株下部叶片凋萎，最后整个植株中部的叶片凋萎，但是也有一侧叶片先出现 萎蔫或全株叶片同时出现萎蔫（高欢乐，2009） 。 青枯雷尔氏菌的菌体呈现出长的椭圆形，近杆状，革兰氏染色为阴性，菌体大小 为0.5-0.81.3-2.2 m，极生鞭毛为1-4根，不能形成荚膜和芽孢。菌体内有聚羟基丁 酸盐颗粒，在显微镜下观察，细胞两极着色较深（Kelman A，1954）。 青枯雷尔氏菌在不同的寄主上的菌落形态一般没有太明显的差异，在普通培养基 上生长的菌落呈圆形，表面光滑，有光泽。在肉汁琼脂平板以及32的条件下培养48 h 后，出现直径为1-4mm的灰白色不规则或近圆形的菌落，菌落的边沿光滑。青枯雷尔氏 菌为好气性的细菌，在厌气的条件下培养，其致病性会迅速丧失。青枯雷尔氏菌在 30的条件下，在TTC（红四氮唑，2，3，5三苯基氯化四氮唑）培养基上划线培养 48h，会出现两种不同的菌落形态：一种是致病性较强的野生型菌株，其菌落呈不规则 或近圆形，边沿较宽，呈白色，流动性较强，菌落中心呈粉红色；另一种是致病力弱 福州大学硕士学位论文 或者丧失致病力的变异菌株，干燥，流动性较差，形态扁平，菌落中心呈现出暗红色， 白边很窄。 青枯雷尔氏菌能在培养基上产氨，但不产酸，可以还原硝酸盐。葡萄糖、蔗糖、 麦芽糖是最主要的碳源；最主要的氮源是蛋白胨以及尿素。青枯雷尔氏菌在长期的传 代培养中，极易出现致病力的分化，从而容易失去致病力。 青枯雷尔氏菌是一种及其复杂的细菌，呈现出高度的分化多样性。根据对不同植 物致病性的差异，将青枯雷尔氏菌划分不同的生理小种（Buddenhgen I，Sequeim L，Kelman A，1962）。到20世纪60年代，已经将其划分为4个生理小种。在2003年陈永 芳，何礼远等将青枯雷尔氏菌划分为5个小种（陈永芳，何礼远，徐进2003）。根据青 枯雷尔氏菌对三种双糖（乳糖、麦芽糖以及纤维二糖）和三种醇（甘露醇、甜醇以及 山梨醇）的氧化能力，Hayward将其划分为4个生理型：、（Hayward A C，1964）。 另外，一些学者还应用单抗、多抗血清学的方法以及RAPD、Rep-PCR、RFLP等分 子生物学的方法研究不同青枯雷尔氏菌之间的差异，提出了很多不同种下的分类方案 （何礼远，康耀卫，1995）。虽然这些研究都没有得出一致的结论，但是却充分的说 明了青枯雷尔氏菌的遗传多样性。Cook等人采用RFLP技术对其进行了较为系统的研究， 将其划分为2个主要的组群：亚洲分支“Asiaticum”和美洲分支“Americanum”，分别包括来自 亚洲和美洲的菌株(Cook D，Sequeira L，1991)。 除了上述的分类方法外，还有青枯雷尔氏菌的致病性和菌系的分化，其依据是青 枯雷尔氏菌对鉴别品种的反应。帅正彬等对四川成都地区番茄的青枯雷尔氏菌的生理 小种进行研究，结果表明，同一生理小种的青枯雷尔氏菌接种番茄后便显出不同的致 病性，得出同一生理小种的菌株，存在致病力的分化这一结论（帅正彬，苏家烈，罗 小波，1997）。 革兰氏阴性细菌有5种类型蛋白分泌系统(Protein secretion system)，即IV型。其中， T3S(Type III secretion systems)、T2S(Type II secretion systems)与青枯菌的致病性密切相关。 青枯菌主要通过T3S来分泌毒性蛋白（Genin S，Boucher C，2004）。T3 S由 hrp(hypersensitive response and patho-genicity)基因编码。青枯菌的hrp基因位于一个大质粒上， 基因簇呈线性排列。青枯菌中除22 kb的hrp基因簇外，还存在一个独立的由1.3 kb和0.7 kb 两个转录单位构成的hrp位点。这两类基因簇之间不存在同源性（Aldon D，Brito B，Boucher C，2000）。第二类hrp基因又被称为附属的hrp位点。Hrp的主要功能是组装 复杂的纤毛和分泌效应子蛋白（Chial M de，Ghysels B，Beatson S A，2003）。T3S组装的 纤毛横跨细菌内外膜，直接将效应子蛋白分泌到植株细胞内。T3S的hrp基因发生突变 会引起青枯菌在寄主体内增殖和定殖能力降低，从而丧失致病力（Kanda A，Ohnishi S，Tomiyama H，2003）。 尽管T3S对青枯菌的致病性贡献很大，但青枯菌的T3s被敲除后，虽然细菌的数量 青枯雷尔氏菌致病力分化的细菌色谱研究 4 有所减少，但突变体仍然具有侵染番茄(Lycopersicon esculentum)根部并在维管系统定 殖的能力，说明T2S在青枯菌的致病过程中也有重要作用（Vasse J，Genin S，Frey P，2000）。青枯菌能通过T2S分泌多种胞外毒性蛋白，如胞外酶、蛋白酶、毒素和毒 性因子，这些胞外蛋白能破坏寄主细胞，引起组织坏死，是导致寄主植物萎蔫的重要 因素。 除与T3S和T2S相关的毒性因子外，还有多种因素影响青枯菌的致病力。青枯菌的 aerA 和dinF基因编码的多药外排泵，是青枯菌具有致病性所必需的，其作用可能是保 护青枯菌免遭寄主抗菌物质的攻击。青枯菌侵染番茄的初期，其与番茄的相互识别及 定殖离不开与鞭毛有关的泳动能力，失去泳动能力的突变株，致病能力显著降低。青 枯菌在具有向化性时才表现出致病性（黄真池，刘媛，曾富华，卢向阳，2008）。 有研究表明，青枯雷尔氏菌存在不同总比病例的分化即强致病力的菌株和无致病 力的菌株，强致病力的菌株侵入植株，可导致植株发病；无致病力的菌株侵入植株， 不能引起植株发病（BalabeI N M，Eweda W E，Mostafa M f，2005）。在一定的条件下， 强致病力的菌株，会逐渐丧失致病性，转化为弱致病性的或无致病性的菌株。但是在 自然条件下，青枯雷尔氏菌能够保持稳定的致病力，抵抗外界不利条件，从而侵入植 株，引起植株发病。 程本亮通过对不同发病时期不同部位的番茄以及生姜植株的青枯雷尔氏菌进行分 离，从发病初期的番茄植株根部后后期的茎部分离到不同致病力的青枯雷尔氏菌，其 中大多数为强致病力的，少数菌株为无致病力的；而从患有青枯病的生姜植株中分离 到的青枯雷尔氏菌均为无致病力的菌株。对强致病力的青枯雷尔氏菌Rs91和Rs1100进行 连续的继代培养，在培养5代之后，青枯雷尔氏菌Rs91没有出现致病力的分化，而青枯 雷尔氏菌Rs1100在第5代时候出现了致病力的分化。 3 3 高效液相色谱在细菌上的应用高效液相色谱在细菌上的应用 色谱技术作为一种重要的分析方法，在生物学领域有着极为广泛的应用。但是在 微生物方面，主要用于细菌成分及代谢产物分析(陈昭华，刘树滔，薛伟明,2004)。例 如，应用气象色谱以特征脂肪酸组成为分类依据来进行细菌的分类。 早在20世纪70年代，就有人利用色谱技术来分析完整的细菌细胞。将微生物悬浮 液与树脂混合后，在用不同浓度的洗脱液进行梯度洗脱后，将不同的细菌组分洗脱下 来，从而达到分离的目的。Marquis等利用阳离子交换层析柱Bio-Rex70分步洗脱，成功地 实现了金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌的分离，且回收率分别为87%和97%（Marquis RE，Mayzel K，1976）。但由于条件的局限性，当时对细菌的分离一般是使用常压色谱 柱，分离时间长，容易染菌；同时由于分离材料上的局限，使用离子交换树脂来进行 细菌分离的研究趋于停止。近年来，随着色谱技术和各种新型分离材料的研究和开发， 又为应用色谱技术分离细菌提供了可能（林 娟 刘树滔 高珍娜 饶平凡，2009）。 在2001年，陈强通过对青枯菌的强、弱致病株系在色谱上的表征，探讨青枯菌的 福州大学硕士学位论文 致病机理，从细菌色谱方面提出了青枯菌致病模型。陈萍以木糖氧化无色杆菌为研究 对象，赖伟苹以金黄色葡萄球菌为研究对象，探讨了这两种细菌整个生长周期的色谱 行为、并分别研究了这两种菌在离子交换树脂上的吸附情况。在这之后，陈昭华以大 肠杆菌中的EPEC、EIEC 各血清型菌种以及肠出血性大肠杆菌中不同标本来源的 E.coliO157:H7 为实验对象，进行 HPIELC 表征，并从细菌表面结构与荷电性质的角度去 揭示细菌吸附于离子交换树脂的本质原因。 3.13.1 高效液相色谱在青枯雷尔氏菌上的应用高效液相色谱在青枯雷尔氏菌上的应用 在2000年，谢俊斌等人首次使用高效液相色谱对活的细菌进行了分离。他们使用 强阴离子交换树脂来对结构完整且具有正常生理活性的细菌进行了分离。与传统的色 谱方法不同，这一研究是以强阴离子交换树脂为介质，以完整的具有生物活性的细菌 个体来进行细菌色谱表征。通过离子交换树脂，他们成功的表征了不同细菌的色谱行 为。成功地将木糖氧化无色杆菌、普通大肠杆菌、短小芽孢杆菌等不同属的混合样品 在色谱上得到分离，从而验证了高效液相离子交换色谱系统用于分离细菌这样的大颗 粒体系的可行性（谢俊斌，2000）。通过研究发现，纯培养的细菌在色谱上表现出单 一的保留峰，且不同细菌的特征峰是不同的。在这一基础上，随后又进行了一系列的 研究包括对细菌进行各种物理和化学的处理后的色谱行为。研究了细菌经过紫外照射、 菌体脱毛处理以及甲醛灭活等处理后的色谱行为差异，验证了高效液相色谱在反应细 菌差异的可行性（赖伟萍，2002）。 在随后的研究中，林娟等应用高效液相色谱对青枯雷尔氏菌进行分离。研究发现 在色谱柱饱和的吸附范围内，青枯雷尔氏菌的纯培养物经色谱分离得到3个明显的特征 峰。然后收集各色谱峰的菌体，染色后镜检，结果发现经过高效液相色谱分离后，细 胞仍然保持结构的完整性，而且生理生化特征以及生化型均没变化（林娟, 马骋, 刘树 滔，2005）。在此实验基础上，采用TTC平板培养这3个色谱峰的菌体，培养48小时后测 定其弱化指数，结果发现这3个特征峰的菌体的弱化指数不相同，而且在运动性方面也 有显著的差异（林娟，马骋，刘树滔，饶平凡，2007）。这一研究证明了高效液相色 谱能够分离青枯雷尔氏菌，能够将其分为不同的几个生理状态。结合番茄感染实验， 在进一步的研究中发现，3个色谱峰的组分在致病力方面有明显的差异，大小分别是组 分3组分2组分1，这一结果为利用高效液相色谱法快速分析检测青枯菌的致病强度 奠定了基础（林娟, 马骋, 刘树滔，2007）。 进一步的研究表明，不同致病力的青枯雷尔氏菌的特征色谱是不同的。通过软件 对青枯雷尔氏菌的各色谱峰面积进行积分，结果发现致病力越强，组分3的面积越大。 弱致病力的青枯雷尔氏菌主要以峰1和峰2为主，强致病力的菌株只出现峰3，从而呈现 出“致病力越强，峰3所占的面积比越大”这一规律（林娟, 马骋, 刘树滔，2006）。 在一定的条件下，细菌是一个宏观上带电的颗粒，组成细菌表面的结构（蛋白质 等）带有羧基、磷酸基和氨基等基团，在不同的pH环境下会发生电离，从而使细菌表 青枯雷尔氏菌致病力分化的细菌色谱研究 6 面带有不同的电荷（陈萍, 李仁宽, 徐小华，2002）。细菌在离子交换过程中表现为“宏 观的两性离子”，当pH大于其等电点时，细菌带负电荷；当pH小于其等电点时，细菌带 正电荷。由于细菌在不同的生理状态下，其细胞表面的的化学组成和结构不同，因而 带电性质不同，与离子交换剂的吸附能力也不同，因此可以通过高效离子交换色谱进 行分离(Lin J(林娟)，Ma C(马骋)，Liu ST(刘树滔)，Rao PF(饶平凡),2007)。 4 4 青枯病的防治研究进展青枯病的防治研究进展 目前对青枯病的防治主要采取化学防治、生物防治和培育抗病品种等措施（徐进, 冯洁,顾刚，2008）。 4.14.1 化学防治化学防治 目前，研究普遍认为化学防治青枯病的难度还很大，其中一个很重要的原因就是 没有专门的特效药（赵从新，郑宇峰,王顺党，2009） 。实验表明，普通的化学药剂只能 延迟青枯病的发病时间，而且药效随着时间的延长逐渐降低。常用的药物比如青枯灵， 在防治实验中表现出了一定的效果。例如，在防治旱地茄子青枯病的田间实验中， 50青枯灵可湿性粉剂喷药约6次，防效达73以上，残药期长达5个月以上（覃新 导罗养，2000）。常用的化学防治还有抗生素防治、植物生长调节剂及植物杀(抑)菌 物质的防治。常用的抗生素有链霉素、四环素和有效霉素等（王舒宁，2006） 。青枯菌 对植物生长调节剂3-吲哚丙酸和3-吲哚丙烯酸专化敏感，因此可能是控制青枯病的有效 药剂（郭坚华,孙平华，1997）。 目前普通的化学药剂在青枯病在防治上主要应用于预防性的植物材料以及土壤的 预处理，很少用于直接治疗。而且化学药剂生产简便，价格便宜见效快，在青枯病的 防治中占有主要的支配地位。而且在大面积的发病时，化学药剂称为唯一的选择。但 是长期使用容易造成环境污染，在实际使用中，应注意选择适量的剂量，尽量减少对 环境的污染(孙思，韦爱梅，伍慧雄，王军，2004)。 4.24.2 生物防治生物防治 生物防治在青枯病上的应用，目前的研究主要包括利用无致病力青枯菌、拮抗细 菌、菌根真菌对病原菌进行抑制，以及利用基因工程对有关植物进行抗病转化。无致 病力菌株是利用病菌的近缘无致病力的种或菌系产生的细菌素来抑制致病菌的(孙思， 韦爱梅，伍慧雄，王军，2004)。 无致病力菌株最早成功的应用于病害防治的例子是用放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)84菌株防治由根癌土壤杆菌( Atumefaciens)引起的桃树冠瘿病。Chen 等用无 致病力产细菌素的青枯菌(ABPS)I2I菌株防治烟草青枯病，发现用产细菌素的菌悬液预处 理烟草比川不产细菌素的菌悬液处理能更有效的防治青枯病（Chen W E Echandi，1984）。 陈庆河等用紫外诱变法获得的靑枯无致病力菌株ATm004和Asp061，接种于番茄植株上， 进行盆栽试验，结果表明，经过处理后，番茄的发病时间分别推迟了9天和7天，20天 后的防效达到56.7%和53.4%，在田间试验结果表明，经过浸根处理，15天后对青枯病的 福州大学硕士学位论文 防效分别达到53.8%和37.7%（陈庆河,翁启勇,胡方平，2003） 。Trigalet等经转座子Tn5从有 毒菌株GMIl229诱变得到无毒突变体。他们在同一植株上同时接种无毒突变体菌和致病 菌。无毒突变体菌能在一定程度上抑制了致病茵的繁殖（Trigalet ATrigalet Demery D，1990）。 康耀卫等研究发现将青枯菌无毒突变株AP7接种到花生植株上，导致其体内过氧化 物酶的活性增强，从而引起花生对毒性菌株的抗病性，表现为接种植株的叶片组织粗 提液对致病力菌株有很强烈的体外抗菌作用，进一步的研究发现，将这种粗提液与致 病菌株同时注入花生叶片内，也表现出了抑制发病的作用，而且这种抑制作用随着粗 提液浓度的下降而减弱（康擢 何礼远，1994）。 拮抗细菌是从根际十壤中稀释分离得到的有益的微生物。日前，已报道的用于防 治青枯病的拮抗细菌主要包括芽孢杆菌属(Bacillus spp)、假单胞杆菌属(Pseudomonas spp) 和链霉菌属(Streptomyces spp)等。芽孢杆菌是拮抗细菌研究中的重点，主要原因是芽孢 杆菌易于分离，分布广，防治效果好。罗宽等从烟草根际和根表土壤等分离鉴定了七 株抗青枯病生防菌，并用其中三株(一株属不动杆菌属，两株属芽孢杆菌属)进行了抑制 烟草青枯病的试验，并初步研究了抗菌物质的理化性质。结果表明拮抗菌株对多个烟 草青枯病菌株有广谱性抑制作用，但效果有一定著异。 关于芽孢杆菌的防病机理，一些学者进行了一系列的研究。邱清华等的试验表明 其抗菌物质可能为蛋白质性质的物质。杨合同等人通过使用巨大芽孢杆菌菌株B1301防 治生姜青枯病的试验中，证明B1301是通过抗菌物质以及竞争作用达到防治青枯病病害 的目的（邱清华姬广海，魏兰芳，2002）。魏春妹等人研究与分析了90B4-2-2拮抗菌 株防治番茄青 枯病的作用机理。实验结果表明90B4-2-2菌株能够在番茄的根际土壤中 繁殖，向根部聚集并且向根组织内部渗透，进而从植株根部转移到茎和叶组织内部繁 殖，强烈抑制青枯病病菌的繁殖和生长，而且还起着催芽和壮苗的作用，与植株建立 互利的关系（魏春妹，张春明，刘宗镇，1994）。 近些年来，分子生物学的新技术的迅速发展为青枯病的防治提供了一些新的途径。 通过转座子等手段诱变得到生防菌是常用的技术。康耀卫等采用转座子Tn5诱变植物青 枯菌获得世界上首例植物青枯菌胞外蛋白输出缺失的突变体，该突变体在缺失了许多 胞外蛋白外输出功能后，从而失去了对寄主的致病能力；进一步的实验发现，突变体 AD4接种植株30天后仍可从根部分离，定殖能力很强；温室内接种20天仍具有防治效果， 但田间试验效果有所下降，需要进一步的改造（康耀卫，毛国璋，吕常胜，1995）。 张景宁将产生柞蚕杀菌肽D的基因导入桉树，从而获得了转基因植株。在将青枯雷尔氏 菌接种于该植株后，存活率明显的得到提高，而且发病较慢，该研究表明转基因桉树 提高了其对青枯病的抗病力（张景宁，张清杰、姨自然，1995）。 目前，普通化学药剂对青枯病在防治主要用于预防性的植物材料前处理及土壤的 预处理，很少直接用于治疗。但化学药剂因其具有生产简便，价格便宜，特别是见效 青枯雷尔氏菌致病力分化的细菌色谱研究 8 快等优点，因此仍然在青枯病的防治中占有主要地位，因而得到了广泛的应用。但在 实际的使用过程中，应该选择适当的药剂，尽量减少其副作用，降低对环境的污染。 抗生素及植物激素等制剂。既有普通化学药的优势。又兼有生物防治的特点。是很有 希望的一类药剂。但还需要不断地筛选和研究。并解决病原菌抗药性的问题。生物防 治的方法目前还都处于实验阶段。进入实际生产的很少。利用无致病力青枯菌菌株、 拮抗细菌、菌根真菌等方法对青枯病都能在一定程度上起到一定的防治效果，但是在 田间条件下的防治效果却不太稳定。如何针对不同的植物，筛选理想有益的的生防菌 在田间使用，以有效控制青枯病的发生和流行，有待进一步研究。分子生物学技术的 发展为青枯病的防治开辟了新的途径，虽然利用基因工程技术防治青枯病目前还处于 起步阶段，但相信随着技术的不断完善和深入，还有着广阔的应用前景。 5 5 本文研究目的和意义本文研究目的和意义 细菌色谱是使用高效液相色谱对完整的细胞进行分析及表征。基于细菌色谱快速、 高效这些特性，本文对不同致病力、不同寄主、不同地域的青枯雷尔氏菌进行色谱分 离表征，构建了青枯雷尔氏菌的特征色谱图库。同时探究不同致病力分化、不同寄主、 不同地域的青枯雷尔氏菌的色谱行为差异。另外本文还探究了无致病力菌株的色谱行 为和其生物防效之间是否存在关系，为快速筛选出菌株来作为植物疫苗工程菌提供了 一种新的思路。 青枯雷尔氏菌的特征色谱图库的建立，为同一致病力的青枯雷尔氏菌划分提供了 一种新的依据。同时，细菌色谱还能够将混合的青枯雷尔氏菌很好的分离开，基于色 谱图的特征峰个数，峰高、峰面积以及峰宽等特征，为判别菌株是否为同一特性的株 系提供了可能。 福州大学硕士学位论文 第二章 青枯雷尔氏菌致病力分化 1 1 前言前言 作物在患青枯病后，可从发病的作物体内分离到不同致病力的青枯雷尔氏菌，这 一研究表明青枯雷尔氏菌在野生环境中存在着致病力的分化，即可分为强致病力菌株 以及无致病力的菌株。在继代培养等特定的条件下，强致病力菌株会逐渐丢失其致病 力，逐渐变成弱致病力的菌株或者无致病力的菌株。 本实验，通过对青枯雷尔氏菌致病力的测定，来探讨其致病力的分化。 2 2 材料及方法材料及方法 2.12.1 材料材料 菌种：青枯雷尔氏菌FJAT-91由福建省农业科学院农业生物资源研究所于发病植株 上分离保存以及Tn-5转座子插入菌株。仪器设备：光学显微镜、超净工作台、高速离心 机、PH计、移液枪、电子天平、恒温培养箱、超纯水机。青枯雷尔氏菌活化培养基： TTC培养基：10 g蛋白胨，1 g水解酪蛋白，5 g葡萄糖，17 g琼脂，1000 mL蒸馏水，pH值 调节到约7.4左右，分装，121 灭菌20 min。灭菌后当冷却至55 左右加入已灭菌的1% 的TTC（2，3，5氯化三苯基四氮唑）水溶液其终浓度为0.005%，最终pH值为7.2左右。 青枯雷尔氏菌发酵培养基：SPA液体培养基：蔗糖2.0%，蛋白胨 0.5%，K2HPO40.05%，MgSO40.025%，最终pH值为7.2左右。分装，121灭菌20 min。 2.22.2 方法方法 青枯雷尔氏菌致病力的测定主要是根据以下方法进行测定即弱化指数测定。通过 弱化指数的测定来划分其致病力强弱。 测定其致病力强弱，方法如下： 1，菌株活化 从-80 冰箱中取出菌株，在 TTC 平板上划线。放入 30 恒温培养箱，培养时间 为 48h。 2，稀释涂板 青枯雷尔氏菌致病力分化的细菌色谱研究 10 从活化的平板上挑取单菌落，置于 10 mL 无菌水，并采用梯度稀释法进行稀释， 稀释至 10-5，10-6。并从 10-5，10-6吸取 100 L 于 TTC 平板进行涂板，每个梯度平行做 3 次。 3.镜检 当菌体在平板上长出单菌落时，用体视显微镜进一步观察菌落形态，测出其弱 化指数。其中， （刘波，2005）(葛慈斌,刘波,朱育菁,林营志,肖荣凤,2004) 直径白边 红边直径 弱化指数 3 3 结果与分析结果与分析 3.13.1 弱化指数的测定弱化指数的测定 当菌体在平板上长出单菌落时，用体视显微镜进一步观察菌落形态，测出其弱化 指数。通过体视显微镜进一步观察菌落形态，青枯雷尔氏菌的菌落表现出 2 种形态： 一种是菌落为深红色，白边较窄，中间为暗红色，没有表现为流动性；另一种表现为 白边较宽，中间表现为粉红色，同时流动性强。 3.1.13.1.1 Tn-5Tn-5转座子插入菌株的弱化指数转座子插入菌株的弱化指数 本实验使用的青枯雷尔氏菌是采用电击法将转座子Tn-5转化进青枯雷尔氏菌FJAT- 91，并随机插入进青枯雷尔氏菌FJAT-91中，得到的不同的供试菌株。测出其弱化指数， 结果见表2-1通过对其弱化指数的测定，得出Tn-5转座子插入菌株的弱化指数的弱化指 数都在0.75-0.85之间，均为弱致病力的菌株。 表2-1 Tn-5转座子插入菌株的弱化指数 Table 2-1 Weakening index of Tn-5 strains of transposon insertion 编号弱化指数致病性编号弱化指数致病性编号弱化指数致病性 T6590.76VT6890.72VT6940.83V T7100.83VT7130.79VT7260.79V T7460.79VT7640.81VT7730.78V T7610.78VT7740.84VT7750.80V T7800.77VT8310.80VT8320.76V T8380.87VT8420.69VT8710.78V T8700.77VT80.81VT3430.75V T7380.83VT4930.83VT4810.84V T4970.82VT1650.76VT4990.80V T4740.77VT4460.76VT5200.79V T3340.75VT1400.80VT3510.80V T5780.84VT9960.83V 附：V表示是弱致病力的菌株,A表示是弱致病力的菌株。 （V：virulent strain；A：avirulent strain） 3.1.23.1.2 自然分离菌株的弱化指数自然分离菌株的弱化指数 通过对自然分离的青枯雷尔氏菌进行弱化指数的测定，这36株菌的弱化指数大多 在0.55-0.76之间，只有FJAT-1001、FJAT-1458和FJAT-443这3株菌的弱化指数在0.7以 福州大学硕士学位论文 上。根据刘波等确认的致病性和弱化指数的相关性，结合其菌落的形态，得出FJAT- 1458和FJAT-443这2株菌是弱致病力的菌株，其他的均为强致病力的菌株。 表2-2 自然分离菌株的弱化指数 Table 2-2 Weakening index of natural isolates strains 编号弱化指数致病性分离地点 FJAT-4320.68A福建晋江 FJAT-4310.61A福建晋江 FJAT-4270.52A福建晋江 FJAT-4340.54A福建晋江 FJAT-4330.59A福建晋江 FJAT-4290.50A福建晋江 FJAT-4280.56A福建晋江 FJAT-4600.55A福建屏南 FJAT-4590.57A福建屏南 FJAT-4630.54A福建屏南 FJAT-4610.62A福建屏南 FJAT-4650