固相萃取-高效液相色谱法测定枸杞子中吡虫啉残留量.doc

固相萃取-高效液相色谱法测定枸杞子中吡虫啉残留量 2009年09月03日 何 强 孔祥虹 李建华 张 莹 摘要：建立固相萃取-高效液相色谱法测定枸杞子中吡虫啉残留量。样品用乙腈提取，中性氧化铝和活性炭固相萃取柱净化，分析时采用Inertsil ODS-3（25 cm 4.6 mm，5m）色谱柱分离，以乙腈-水为流动相梯度洗脱，流速1.0 mLmin-1，检测波长为270 nm，柱温35 。结果表明，在0.02 mgL-15.0 mgL-1范围内，吡虫啉峰面积与浓度呈良好的线性关系（r=0.9999），枸杞子样品中吡虫啉能得到良好的分离，回收率及重复性良好。该法可用于枸杞子中吡虫啉残留量的检测。关键词：枸杞子；吡虫啉；高效液相色谱；固相萃取Determination of imidacloprid resi-due in Lycium by gradient RP-HPLC HE Qiang, KONG Xiang-hong, LI Jian-hua, ZHANG Ying Abstract Objective: To establish a method for the determination of imidacloprid in Lycium by gradient RP-HPLC. Sample preparation involves extraction with acetonitrile. Final clean-up were performed on an Alumina Neutral SPE Column and an Active Charcoal column, using the column in tandem. Chromatographic analysis was performed on Inertsil ODS-3（25cm 4.6mm，5m）column. The gradient elution was used with a flow rate of 0.1 molL-1. Mobile phase A: acetonitrile ; Mobile phase B: 0. 01 molL-1 potassium dihydrogen phosphate buffer（PH3.3）. ConCondition of the gradient elution: 0 15 min，A: 15%，1517 min, A from 15% to 30%, 1725 min, A: 15%; the detection wavelength was 246 nm. Imidacloprid in measured samples was separated completely. The calibration curve was linear at the range of 0.0005 mgL-10.1 mgL-1 with good precision and accuracy. The method was applied to the determination of imidacloprid residues in Lycium. Key words: Lycium; imidacloprid; HPLC; solid phase extraction吡虫啉(Imidacloprid)是一种内吸性吡啶类杀虫剂，化学名称为1-(6-氯-3-吡啶基甲基)-N-硝基亚咪唑烷-2-基胺。吡虫啉具有高效、低毒、广谱的特点，并且对蚜虫、飞虱、叶蝉等害虫有特效。枸杞子为茄科植物宁夏枸杞的干燥成熟果实1，在宁夏枸杞种植区，该农药是防治枸杞蚜虫的首选药剂，用量较大。近年来，测定吡虫啉残留的方法主要有高效液相色谱法和液质联用法24，但前处理都比较复杂，分离效果不好。本文建立了梯度洗脱反相高效液相色谱法测定枸杞子中吡虫啉残留量。本方法准确、可靠，对枸杞子中吡虫啉的分离良好，回收率及重复性均符合农药残留测定要求。1 仪器与试药Agilent 1200型高效液相色谱系统：配四元泵、DAD检测器、自动进样器及色谱数据处理工作站（美国Agilent公司）；旋转蒸发仪（LABOROTA 4001，德国Heidolph公司）；ENVI- Carb固相萃取柱（3mL，美国SUPELCO公司）；SupelcleanTM LC-Alumina N固相萃取柱（3mL，美国SUPELCO公司）。吡虫啉对照品（Sigma公司，纯度99.2 %）；乙腈（色谱纯，Fisher 公司）；水为超纯水（PURELAB PULS超纯水器制备）；其他试剂均为分析纯。2 实验方法2.1 色谱条件色谱柱：Inertsil ODS-3（25cm 4.6mm，5m）；流动相：乙腈-水系统，010min乙腈从10%线性递增至30%，1018 min乙腈再从30%线性递减至10%；流速：1.0 mLmin-1；色谱柱温度：35；检测波长270 nm，参比波长300 nm；进样量：50L。应用上述条件，取0.5mgL-1的吡虫啉对照品溶液进样，色谱图见图1。图1吡虫啉对照品HPLC图谱Fig 1 HPLC chromatogram of imidacloprid standard1. 吡虫啉（imidacloprid）2.2 样品的提取和净化2.2.1 样品提取称取充分粉碎的干燥枸杞子样品2.0g，加入10 mL水，剧烈振摇使之充分分散，加入34g NaCl和20mL乙腈，振摇提取10min，3000r/min 离心3 min，取上层乙腈层，下层再用15 mL2的乙腈提取2次，合并提取液，40减压蒸至近干，氮气吹干，5 mL丙酮-正己烷（20:80）溶解。2.2.2 样品净化中性氧化铝柱串联活性炭柱净化：将中性氧化铝柱先用5mL正己烷预淋洗，然后把“2.2.1”中的提取液过柱，先用5mL丙酮-正己烷（20:80）洗涤，弃去洗涤液，再用10mL丙酮-正己烷（80:20）洗脱，洗脱时下面串联活性炭柱，洗脱液40减压旋转蒸发至近干，氮气吹干，1.0 mL乙腈-水（30:70）溶解，过0.45m的滤膜，进样检测。3 实验结果3.1 线性关系考察分别配制浓度为0.02, 0.05, 0.10, 0.25, 0.50, 1.00, 2.00, 5.00 mgL-1的系列对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，并以对照品浓度（X，mgL-1）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标作图，同时用最小二乘法进行线性回归，得标准曲线回归方程：Y = 185.74 X +1.2102,r = 0.9999，在0.025.00 mgL-1范围内，吡虫啉浓度与峰面积值有良好的线性关系。3.2 精密度与重复性取对照品和供试品溶液，连续进样6次，对照品和供试品中吡虫啉峰面积的RSD分别为0.96%,1.28%精密度良好。按照“2.2”项下方法，平行称取6份含吡虫啉的枸杞子样品，制备供试品溶液，依法进样测定，计算含量，结果为0.095，0.086，0.089，0.10，0.098，0.091 mgkg-1，RSD为5.69%，重复性良好。3.3 加样回收率实验为了考察方法的回收率，对15份枸杞子样品进行加标回收实验，加标水平为0.05，0.10，0.20 mgkg-1，每个水平5个平行样品，样品及样品加标的HPLC图谱如图2所示，检测结果见表1。图2 枸杞子样品加标0.20g（A）和样品（B）的HPLC色谱图Fig 2 HPLC chromatogram of Lycium with 0.20 g imidacloprid added (A) and without imidacloprid (B) 1. 吡虫啉（imidacloprid）表1 方法回收率测定结果（n=5）Tab 1 Recovery of imidacloprid in Lycium (n=5)样品含量(content)/mgkg-1加标量(added)/ mgkg-1测定值(measured)/ mgkg-1平均回收率(average recovery)/ %RSD/ %0.0460.050.08987.26.290.100.13791.54.620.200.24095.93.063.4 检测限按“2.1”项下色谱条件，将对照品溶液稀释进样，以10倍噪音（S/N = 10）计，本方法最小检固相萃取-高效液相色谱法测定枸杞子中吡虫啉残留量 2009年09月03日 何 强 孔祥虹 李建华 张 莹 摘要：建立固相萃取-高效液相色谱法测定枸杞子中吡虫啉残留量。样品用乙腈提取，中性氧化铝和活性炭固相萃取柱净化，分析时采用Inertsil ODS-3（25 cm 4.6 mm，5m）色谱柱分离，以乙腈-水为流动相梯度洗脱，流速1.0 mLmin-1，检测波长为270 nm，柱温35 。结果表明，在0.02 mgL-15.0 mgL-1范围内，吡虫啉峰面积与浓度呈良好的线性关系（r=0.9999），枸杞子样品中吡虫啉能得到良好的分离，回收率及重复性良好。该法可用于枸杞子中吡虫啉残留量的检测。关键词：枸杞子；吡虫啉；高效液相色谱；固相萃取Determination of imidacloprid resi-due in Lycium by gradient RP-HPLC HE Qiang, KONG Xiang-hong, LI Jian-hua, ZHANG Ying Abstract Objective: To establish a method for the determination of imidacloprid in Lycium by gradient RP-HPLC. Sample preparation involves extraction with acetonitrile. Final clean-up were performed on an Alumina Neutral SPE Column and an Active Charcoal column, using the column in tandem. Chromatographic analysis was performed on Inertsil ODS-3（25cm 4.6mm，5m）column. The gradient elution was used with a flow rate of 0.1 molL-1. Mobile phase A: acetonitrile ; Mobile phase B: 0. 01 molL-1 potassium dihydrogen phosphate buffer（PH3.3）. ConCondition of the gradient elution: 0 15 min，A: 15%，1517 min, A from 15% to 30%, 1725 min, A: 15%; the detection wavelength was 246 nm. Imidacloprid in measured samples was separated completely. The calibration curve was linear at the range of 0.0005 mgL-10.1 mgL-1 with good precision and accuracy. The method was applied to the determination of imidacloprid residues in Lycium. Key words: Lycium; imidacloprid; HPLC; solid phase extraction吡虫啉(Imidacloprid)是一种内吸性吡啶类杀虫剂，化学名称为1-(6-氯-3-吡啶基甲基)-N-硝基亚咪唑烷-2-基胺。吡虫啉具有高效、低毒、广谱的特点，并且对蚜虫、飞虱、叶蝉等害虫有特效。枸杞子为茄科植物宁夏枸杞的干燥成熟果实1，在宁夏枸杞种植区，该农药是防治枸杞蚜虫的首选药剂，用量较大。近年来，测定吡虫啉残留的方法主要有高效液相色谱法和液质联用法24，但前处理都比较复杂，分离效果不好。本文建立了梯度洗脱反相高效液相色谱法测定枸杞子中吡虫啉残留量。本方法准确、可靠，对枸杞子中吡虫啉的分离良好，回收率及重复性均符合农药残留测定要求。1 仪器与试药Agilent 1200型高效液相色谱系统：配四元泵、DAD检测器、自动进样器及色谱数据处理工作站（美国Agilent公司）；旋转蒸发仪（LABOROTA 4001，德国Heidolph公司）；ENVI- Carb固相萃取柱（3mL，美国SUPELCO公司）；SupelcleanTM LC-Alumina N固相萃取柱（3mL，美国SUPELCO公司）。吡虫啉对照品（Sigma公司，纯度99.2 %）；乙腈（色谱纯，Fisher 公司）；水为超纯水（PURELAB PULS超纯水器制备）；其他试剂均为分析纯。2 实验方法2.1 色谱条件色谱柱：Inertsil ODS-3（25cm 4.6mm，5m）；流动相：乙腈-水系统，010min乙腈从10%线性递增至30%，1018 min乙腈再从30%线性递减至10%；流速：1.0 mLmin-1；色谱柱温度：35；检测波长270 nm，参比波长300 nm；进样量：50L。应用上述条件，取0.5mgL-1的吡虫啉对照品溶液进样，色谱图见图1。图1吡虫啉对照品HPLC图谱Fig 1 HPLC chromatogram of imidacloprid standard1. 吡虫啉（imidacloprid）2.2 样品的提取和净化2.2.1 样品提取称取充分粉碎的干燥枸杞子样品2.0g，加入10 mL水，剧烈振摇使之充分分散，加入34g NaCl和20mL乙腈，振摇提取10min，3000r/min 离心3 min，取上层乙腈层，下层再用15 mL2的乙腈提取2次，合并提取液，40减压蒸至近干，氮气吹干，5 mL丙酮-正己烷（20:80）溶解。2.2.2 样品净化中性氧化铝柱串联活性炭柱净化：将中性氧化铝柱先用5mL正己烷预淋洗，然后把“2.2.1”中的提取液过柱，先用5mL丙酮-正己烷（20:80）洗涤，弃去洗涤液，再用10mL丙酮-正己烷（80:20）洗脱，洗脱时下面串联活性炭柱，洗脱液40减压旋转蒸发至近干，氮气吹干，1.0 mL乙腈-水（30:70）溶解，过0.45m的滤膜，进样检测。3 实验结果3.1 线性关系考察分别配制浓度为0.02, 0.05, 0.10, 0.25, 0.50, 1.00, 2.00, 5.00 mgL-1的系列对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，并以对照品浓度（X，mgL-1）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标作图，同时用最小二乘法进行线性回归，得标准曲线回归方程：Y = 185.74 X +1.2102,r = 0.9999，在0.025.00 mgL-1范围内，吡虫啉浓度与峰面积值有良好的线性关系。3.2 精密度与重复性取对照品和供试品溶液，连续进样6次，对照品和供试品中吡虫啉峰面积的RSD分别为0.96%,1.28%精密度良好。按照“2.2”项下方法，平行称取6份含吡虫啉的枸杞子样品，制备供试品溶液，依法进样测定，计算含量，结果为0.095，0.086，0.089，0.10，0.098，0.091 mgkg-1，RSD为5.69%，重复性良好。3.3 加样回收率实验为了考察方法的回收率，对15份枸杞子样品进行加标回收实验，加标水平为0.05，0.10，0.20 mgkg-1，每个水平5个平行样品，样品及样品加标的HPLC图谱如图2所示，检测结果见表1。 图2 枸杞子样品加标0.20g（A）和样品（B）的HPLC色谱图Fig 2 HPLC chromatogram of Lycium with 0.20 g imidacloprid added (A) and without imidacloprid (B) 1. 吡虫啉（imidacloprid）表1 方法回收率测定结果（n=5）Tab 1 Recovery of imidacloprid in Lycium (n=5)样品含量(content)/mgkg-1 加标量(added)/ mgkg-1 测定值(measured)/ mgkg-1 平均回收率(average recovery)/ % RSD/ % 0.046 0.05 0.089 87.2 6.29 0.10 0.137 91.5 4.62 0.20 0.240 95.9 3.06 3.4 检测限按“2.1”项下色谱条件，将对照品溶液稀释进样，以10倍噪音（S/N = 10）计，本方法最小检出浓度为0.01 mgL-1。以称取2.0 g枸杞子样品，定容1.00 mL计算，枸杞子中吡虫啉残留的最低检出限为0.005 mgkg-1。3.5 样品测定利用本方法测定了15批枸杞子样品，提取回收率与色谱分离均良好，其中13批检出含有吡虫啉残留，最低0.012 mgkg-1，最高0.21 mgkg-1，只有两批未检出。4讨论4.1 提取净化条件枸杞子富含多糖类物质，提取时容易粘结成团，影响提取效率，所以提取前一定要将枸杞子充分粉碎，提取时加入适量的水并剧烈振摇，使多糖类物质溶解，枸杞子基质充分分散，提高提取回收率。选用用乙腈作为提取溶剂，是因为乙腈极性较大，可以减少脂溶性杂质的萃出，而提取是在乙腈-水系统中进行，水溶性杂质的萃出也较少。称样量不大于2.5g，否则超过活性炭吸附容量，有较多杂质流出。提取液的净化考察了硅胶、Florisil硅土、C18、中性氧化铝、活性炭等固相萃取柱，发现利用串联中性氧化铝和活性炭固相萃取柱净化的效果较好，色谱干扰小。利用中性氧化铝柱净化时考察了洗脱溶剂的比例和体积，发现用20:80的丙酮-正己烷10mL洗脱未能将吡虫啉从萃取柱上洗下，而且能够观察到萃取柱上有一明显的黄色杂质色带被洗下，用40:60的丙酮-正己烷10 mL洗脱，则有约60 %的吡虫啉洗下，洗脱至20 mL未能洗脱完全，而用80:20的丙酮-正己烷10 mL可以将吡虫啉完全洗下，通过色谱检测，发现用40:60的丙酮-正己烷和80:20的丙酮-正己烷洗脱所得的溶液在吡虫啉出峰位置的色谱峰基本相同，所以选用80:20的丙酮-正己烷。利用活性炭固相萃取柱可以除去色素类物质，使色谱基线更加平稳，而利用80:20的丙酮-正己烷10mL洗脱时，吡虫啉在活性炭柱上基本无吸附。4.2 色谱条件的选择枸杞子样品基质十分复杂，虽然经过净化处理，仍然含有较多的杂质，所以要通过梯度系统洗脱，才能够获得良好的分离，而且通过实验发现，在梯度洗脱时，吡虫啉在乙腈比例降低阶段（1018min）出峰比在乙腈比例升高阶段（010min）出峰的分离情况要好，但出峰时间太晚则峰形变宽，灵敏度降低。检测波长选用吡虫啉的最大紫外吸收波长270 nm，因为吡虫啉的出峰位置后存在一小的干扰峰，而且最大吸收波长在300nm，而吡虫啉在300nm基本无紫外吸收，所以选用300nm为参比波长，既可以有效的屏蔽掉干扰峰，又不影响吡虫啉的灵敏度。参考文献1ChP (2005). Vol (中国药典2005年版. 一部) S. 2005: 174.2Kumar J., Prasad B. R., Singh V. S., et al. Imidacloprid residues in rice grains and strawJ. Annals of Plant Protection Sciences, 2005 ,13(1)：249-251.3Ralf Schning, Richard Schmuck. Analytical determination of imidaclop-rid and relevant metabolite residues by LC MS/MS J. Bulletin of Insectology, 2003, 56(1): 41-50.4Keh Chuh Ting, Eddie Guangming Zhou, Nirmal Saini. Determination of Imidacloprid in Fruits and Vegetables by Liquid Chromatography with Diode Array and Nitrogen-Specific Chemiluminescence DetectionJ. Journal of AOAC.（原载陕西检验检疫科技2008第2期)出浓度为0.01 mgL-1。以称取2.0 g枸杞子样品，定容1.00 mL计算，枸杞子中吡虫啉残留的最低检出限为0.005 mgkg-1。3.5 样品测定利用本方法测定了15批枸杞子样品，提取回收率与色谱分离均良好，其中13批检出含有吡虫啉残留，最低0.012 mgkg-1，最高0.21 mgkg-1，只有两批未检出。4讨论4.1 提取净化条件枸杞子富含多糖类物质，提取时容易粘结成团，影响提取效率，所以提取前一定要将枸杞子充分粉碎，提取时加入适量的水并剧烈振摇，使多糖类物质溶解，枸杞子基质充分分散，提高提取回收率。选用用乙腈作为提取溶剂，是因为乙腈极性较大，可以减少脂溶性杂质的萃出，而提取是在乙腈-水系统中进行，水溶性杂质的萃出也较少。称样量不大于2.5g，否则超过活性炭吸附容量，有较多杂质流出。提取液的净化考察了硅胶、Florisil硅土、C18、中性氧化铝、活性炭等固相萃取柱，发现利用串联中性氧化铝和活性炭固相萃取柱净化的效果较好，色谱干扰小。利用中性氧化铝柱净化时考察了洗脱溶剂的比例和体积，发现用20:80的丙酮-正己烷10mL洗脱未能将吡虫啉从萃取柱上洗下，而且能够观察到萃取柱上有一明显的黄色杂质色带被洗下，用40:60的丙酮-正己烷10 mL洗脱，则有约60 %的吡虫啉洗下，洗脱至20 mL未能洗脱完全，而用80:20的丙酮-正己烷10 mL