肠球菌课件

食品中肠球菌的检验,辽宁出入境检验检疫局技术中心 生物检验科,二00六年四月,Liaoning Inseception and Quarantine Bureau,概述,在细菌分类学上，肠球菌属原归属于链球菌属D群，肠球菌属内包括12个种及一个变异株，包括寄生于人类、牛及其他反刍动物的粪肠球菌和寄生于人类，牛及其他反刍动物、家禽和猪中的屎肠球菌等。是粪便中的常见细菌，在外界难以繁殖，在自然界 的水和土壤中分布较少。,粪肠球菌（E.faecalis） 屎肠球菌（E.faecium) 鸟肠球菌(E.avium) 酪黄肠球（E.casseliflavus) 坚忍肠球菌(E.durans) 鸡肠球菌E.galinarum) 芒地肠球菌(E.mundii) 恶臭肠球菌(E.maladoratum) 希拉肠球菌(E.hirae) 孤立肠球菌（E.solitarius） 棉子糖肠球菌(E.raffinosus) 假鸟肠球菌(E.pseudoavium) 粪肠球变异株(E.faecalis var),肠球菌12个种及其变异株,卫生学意义,肠球菌对环境适应性强，营养要求不高，与大肠杆菌相比，它们对冷冻、高酸和中等热处理的抵抗力更强。因此，肠球菌在冷冻食品、果汁及热处理不够彻底的食品常常能被检测出来，而在这些加工过的食品中大肠杆菌往往已被杀死。肠球菌生态活动与大肠菌群类似，对恶劣的外环境和冷冻条件具有较强的抵抗力，作为监测水质卫生，环境卫生质量的污染指标更具有卫生学意义。在国外，肠球菌检测常用于环境水质和生活饮用水污染状况的评估。有些国家已经制定了肠球菌污染限量标准，一般控制在105 个/g范围内。,生物学性状,肠球菌属的细菌为革兰氏阳性球菌，呈单个，成对或短链状排列，无荚膜。琼脂平板上生长的细菌呈球杆状，液体培养基中呈卵圆形、链状排列。少数菌种有稀疏鞭毛，陈旧培养物或在厌氧状态下有时呈革兰氏阴性。能分解葡萄糖、乳糖、蔗糖，能耐受60、30 min的加热。,培养特性,兼性厌氧菌，最适生长温度35；大多数菌株在10和45均能生长。所有菌株在含6.5%NaCl肉汤中能生长，在40胆汁培养基中能分解七叶苷，不含细胞色素氧化酶和触酶。,检验方法,平板计数法 MPN测定法 滤膜法,平板记数法,此方法适用于检验未经加工处理的生鲜食品及肠球菌菌数10个/g（mL）的食品。,25g(mL)+225mL无菌生理盐水,做成几个适当倍数稀释液,选择2-3个适宜连续稀释度，各取1mL分别加入灭菌培养皿内,KF琼脂,胆汁七叶苷叠氮钠琼脂,卡那霉素七叶苷叠氮盐（KAA）琼脂,Packu结晶紫叠氮盐血琼脂,柠檬酸叠氮化琼脂,菌落计数,报告结果,选择2-3个适宜连续稀释度的样液，分别用灭菌吸管吸取1mL稀释液，接种于每个灭菌的培养皿中，每个稀释度做两个培养皿。 稀释液加入培养皿后，每个培养皿倾注约12-15mL，已灭菌温度保持45的KF琼脂或胆汁七叶苷叠氮钠琼脂，轻轻转动培养皿，使样液与培养基充分混合。水平放置，使琼脂凝固。从制备最初稀释液结束到倾注培养基于最后一个培养皿所用时间不应超过20min。 待混合物凝固后，倒置平板进行培养：KF平板置361培养482h；胆汁七叶苷叠氮钠平板置361培养242h。,KF琼脂或胆汁七叶苷叠氮钠琼脂平板计数法,菌落计数及报告结果： 肠球菌属细菌在KF平板上形成暗红至粉红色菌落，边缘整齐。琼脂表面以下菌落常呈椭圆或晶体状；在胆汁七叶苷叠氮钠琼脂平板形成带棕色环的棕黑色菌落。对有30-300个菌落的平板进行菌落计数。,卡那霉素七叶苷叠氮盐（KAA）琼脂涂布计数法,Mossel（1978）提出了用七叶苷叠氮卡那霉素琼脂代替上述培养基，该方法目前被国际食品微生物和卫生委员会推荐使用。在已制好并凝固的培养基表面涂布接种01mL样品稀释液，于37或42培养，使用42的培养温度可增加其选择性。 肠球菌的菌落较小（直径最大为2mm），白色或灰色，被大的黑色晕圈所包围。因分解七叶苷而产生。,柠檬酸叠氮化琼脂平板计数法,选择2-3个适宜连续稀释度的样液，分别用灭菌吸管吸取1mL稀释液，接种于每个灭菌的培养皿中，每个稀释度做两个培养皿。稀释液加入培养皿后，每个培养皿倾注约10-12 mL，已灭菌温度保持45的叠氮化柠檬酸盐琼脂，轻轻转动培养皿，混匀。凝固后，再倾注3-4 mL灭菌叠氮化柠檬酸盐琼脂于已凝固的培养基上作为隔层。待该隔层凝固后，反转制备好的平板于371培养48-72h。,菌落计数及报告结果： 肠球菌属细菌在叠氮化柠檬酸盐琼脂平板上形成蓝色菌落。使用有适当光源的低倍大视野双目解剖镜或效能相当的其他光学仪器，对有30-300个菌落的平板进行菌落计数。,最近似值（MPN）法检测食品和水中肠球菌,对于污染程度低的样品，可采用MPN技术，用麦芽糖叠氮盐肉汤（KF链球菌肉汤）或叠氮盐葡萄糖肉汤作为液体培养基。此方法适用于污染程度低的样品，检验含有受损伤的肠球菌的加工食品及肠球菌菌数10g/（mL）的食品。,检 样,稀 释,叠氮化钠葡萄糖肉汤管 37+1，24h+2h或48h+2h,麦芽糖叠氮盐肉汤管 37 48h,混浊不明显,混浊,产酸,肠球菌阴性,PSE琼脂平板37+1，24h+2h,带棕色环的棕黑色菌落,肠球菌阳性,肠球菌阳性,MPN值法报告肠球菌数/g（mL）,不产酸,肠球菌阴性,叠氮盐葡萄糖肉汤多管法,（1）根据食品卫生要求或对样品污染情况的估计，选择2-3个适宜连续稀释度的样液，分别用灭菌吸管吸取1mL稀释液，接种于叠氮化钠葡萄糖肉汤管。接种量为1mL时，使用10mL单料管；接种量为10mL时，使用10mL双料管。接种后的试管置371培养24h2h，检查各试管混浊情况。若混浊不明显，继续培养至48h2h后记录结果。 （2）培养242h或482h之后，对所有呈现混浊的叠氮化钠葡萄糖肉汤管进行确证试验。用接种环将各管培养物划线于PSE琼脂平板，倒置平板于371培养242h。琼脂平板上出现的带棕色环的棕黑色菌落，确证为肠球菌属细菌。 （3）最近似值（MPN）的估算：根据接种的样品量和确证为肠球菌属细菌的阳性反应管数，查MPN值表，得出样品中肠球菌最近似值，报告为肠球菌数/g（mL）。,麦芽糖叠氮盐肉汤多管法,食品样品中的低污染浓度肠球菌的检测需使用多管培养技术，用麦芽糖叠氮盐肉汤作选择培养基。无菌移取1mL系列稀释液到盛有麦芽糖叠氮肉汤的试管中，每个稀释度加5个试管。35培养48h后检查产酸情况，试管中产酸表示有肠球菌存在。通过查阅最大可能值表得到肠球菌的最大可能数。,滤膜法检测食品和水中肠球菌,（1）恒温水浴箱 （2）恒温培养箱 （3）菌落计数器 （4）玻璃、耐高温塑料、陶瓷或不锈钢过滤器 （5）真空泵 （6）滤膜：直径47mm，微孔直径0.450.4um （7）低倍大视野双目解剖镜，也可用效能相当的其它光学仪器计数。 （8）纯水器,根据食品卫生要求或对样品污染情况的估计，选择适宜稀释度的样液。样品加样量，以能在滤膜上生长出20-60个菌落为宜。每个样品至少选择三个样品加样量进行过滤。用无菌镊子夹取滤膜，将滤膜放至滤器底部。过滤样品，用20-30mL灭菌的缓冲清洗液轻洗漏斗边缘至少两次。关闭真空泵，移走漏斗。,接种与培养,用无菌镊子移取滤膜，将已滤过样液的滤膜紧贴在mEI琼脂表面上，防止滤膜与琼脂间产生气泡，如有气泡产生，重新放置滤膜。倒置平板于410.5培养24h。,肠球菌的计数,肠球菌属细菌在mEI琼脂平板的滤膜上形成带有蓝色晕轮的菌落，选择生长20-60个带有蓝色晕轮菌落的滤膜，使用有适当光源的低倍大视野双目解剖镜或效能相当的其他光学仪器进行计数。 选择生长20-60个带有蓝色晕轮菌落的滤膜，根据所使用