分子生物学总结.doc

药学院 中药学 8158一、名词解释： 2.5生物大分子：指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类、糖类。5.ORF：开放阅读框架 open reading frame，指在DNA链上，由蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码为止的一个连续编码序列。6.结构基因：决定蛋白质(包括酶)分子一级结构的一段核苷酸顺序（基因）。这类基因可被转录形成 mRNA，并转译成多肽链，构成各种结构蛋白质，催化各种生化反应的酶和激素等。7.断裂基因：又称隔裂基因，在真核基因中,编码顺序被一个或多个称为内含子的非编码区分隔成几段。这种由许多交替出现的编码区和非编码区所组成基因被称作断裂基因。8.选择性剪接：是指选择性地对pre-mRNA不同的剪接位点的组合剪接方式.通过选择性剪接,由一条pre-mRNA可生成多条的成熟mRNA.9.C值：一种生物体单倍体基因组DNA的总量，用以衡量基因组的大小。25.酚抽提法（SDS）：是一种DNA分离纯化方法，最初于1976年由Stafford及其同事提出，通过改良，以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需的DNA样品。25.凝胶过滤层析：亦称凝胶色谱、排阻色谱或分子筛，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。45.退火：热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退火”。55.多重PCR：指在一个反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段，由于每对引物扩增的片段长度不同，可用琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等技术加以鉴别。57.实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 58.荧光域值：以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号, 一般荧光阈值定义为3个至15个循环荧光信号的标准偏差的10倍。59.Ct值：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。63.基因诊断:通过检测基因的结构异常或其表达异常，对人体的健康状态和疾病做出诊断的方法。1.分子生物学：是以生物分子为靶标，在细胞内从分子水平研究生命现象和生命过程规律的一门交叉学科。2.生物分子：泛指生物体特有的各类分子，是自然存在于生物体中的分子的总称，是组成生命的基本单位。3.生物小分子：细胞内具有活性的小分子有机物和无机物。4.基因：携带有遗传信息的 DNA或 RNA序列，也称为遗传因子。 10.基因组：一个细胞内的全部遗传信息，包括染色体基因组和染色体外基因组。11.基因重叠：同一段DNA片段能够参与编码两种甚至两种以上的蛋白质分子。12.多顺反子 mRNA：病毒基因组DNA序列中功能上相关的蛋白质的基因或 rRNA的基因往往丛集在基因组的一个或几个特定的部位，形成一个功能单位或转录单元。它们可被一起转录成含有多个 mRNA 的分子。13.类核：原核生物基因组通常由一条环状的双链DNA分子组成，在细胞中与蛋白质结合成染色体的形式，在细胞内形成一个致密的区域。14.插入序列：2000bp以内，两端都有正向重复序列（DR）和反向重复序列（IR），中间1kb左右的编码序列，仅编码和转座有关的转座酶。只有当 IS 转座到某一基因中使该基因失活或插入位点旁边的染色体发生畸变等效应时才会被发现。15.复合型转座子：200020000bp之间，两端由一对 IS 元件组成，带有与转座作用有关的基因以及其他基因。 16.质粒：一类染色体外具有自主复制能力的环状双链DNA分子，属染色体外基因组。严紧控制型质粒：其复制常与宿主的繁殖偶联，拷贝数较少，每个细胞中只有1个到十几个拷贝。松弛控制型质粒：其复制与宿主不偶联，每个细胞中有几十到几百个拷贝。17.质粒的不相容性：两种不同质粒因利用同一复制和维持机制，在复制和随后向子代细胞分配的过程中会发生竞争，从而不能在同一宿主细胞内稳定存在，其中一种质粒将被丢失。18.基因组学：对生命有机体全基因组进行序列分析和功能研究的学科。19.基因定位克隆：利用微卫星和SNP全基因组扫描来搜索与疾病性状紧密相关的位点，从而确定疾病相关基因的位置并进一步获得克隆。20.功能基因组学：根据已有基因的功能推测基因组中具有相似结构的基因的功能，通过实验手段验证。有效的方法有定点突变、基因敲除和RNA干扰及过量表达技术等。21. 蛋白质组：指由一个基因组，或一个细胞、组织表达的所有蛋白质。22.蛋白质组学：以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律。23.功能蛋白质组：细胞在某一阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。24.差异蛋白质组：不同种类或状态下各种样本之间蛋白质组的区别与变化。26.电泳：蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳。27.基因工程：又称DNA重组技术，是指将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内复制和表达的技术。28.分子克隆：是指将目的DNA片段与载体重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复制、扩增，以获得该DNA分子大量拷贝的技术。29.回文结构：指双链DNA分子上按对称轴排列的反向互补序列（常为限制酶所识别）。30.粘性末端：指限制酶错位切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。31.平末端：指限制酶平齐切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。32.同工异源酶：指来源不同，但能识别和切割同一位点的酶。 33.同尾酶：指识别序列不同，但能产生相同粘性末端的酶。34.载体：指能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。载体的本质为DNA。35.溶菌性噬菌体：指噬菌体感染细胞后，连续增殖，直到细菌裂解，释放的噬菌体又可感染其它细菌。36.溶原性噬菌体：指噬菌体感染细胞后，可将自身的DNA整合到细菌的染色体中，和细菌染色体一起复制。37.报告基因：是指处于待测基因下游并通过转录和表达水平来反映上游待测基因功能的基因，又称报道基因。38.基因组文库（G-文库）：是指含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群。39.转化：是指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。40.感受态细胞：细胞膜结构改变、通透性增加并具有摄取外源DNA能力的细胞。41.核酸变性：在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA由双螺旋变成单链过程。42.增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。43.融解温度：在热变性过程中，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度或融解温度。具有爆发性和狭窄性。44.复性：指变性 DNA 在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。46.核酸分子杂交：两条DNA链或两条RNA链或一条DNA链和一条RNA链按碱基互补的原则缔合成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交。47.核酸探针：是指能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，杂交后可用特殊方法检测的已知被标记的核酸分子。48.cDNA：是指与mRNA互补的DNA分子。49.固相分子杂交：是将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，然后放入含有标记探针的杂交液中，进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，故称固体杂交。50.原位杂交：是以特定标记的已知序列的核酸分子作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其检测的方法。51.荧光原位杂交：是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。52.基因芯片：又称DNA芯片或DNA微阵列，是指集成了大量DNA片段的玻璃片或纤维膜等载体。53.引物:人工合成的两段寡核苷酸序列，决定RCP的特异性。54.one-step RT-PCR：在同一体系中加入逆转录酶、逆转录引物、Taq DNA聚合酶、PCR引物、dNTP和缓冲液，直接以mRNA为模板进行逆转录和PCR扩增，称为一步法RT-PCR。60.阈值高度：是基线范围内荧光信号强度标准偏差的10倍。 56.重组PCR：将两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR称为重组PCR。61.代谢组学：通过考察生物体系（细胞、组织或生物体）受刺激或扰动后（如将某个特定的基因变异或环境变化后），其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的一门科学。62.miRNA：是由2125个核苷酸组成的非编码RNA；它通过与靶基因的3-UTR的配对，促进mRNA的降解或抑制mRNA的翻译从而抑制其靶基因的表达；它在生物体生长发育、细胞增殖、分化、凋亡以及人类各种疾病的发生发展过程中发挥重要的调控作用。64.血红蛋白病：是由于珠蛋白基因异常导致珠蛋白肽链结构异常或合成异常所引起的遗传性血液病。65.基因治疗：狭义上指将具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。广义上是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。66.干细胞：一种具有复制能力、可以形成各种组织的早期未分化细胞67.反义技术 ：是指利用人工合成的反义RNA和反义DNA来阻断基因的转录或复制，控制细胞生长在中间阶段，使编码蛋白质的基因能转录为mRNA，因而不能翻译成相应的蛋白质，以达治疗某一疾病的目的 68.靶向性：是指在治疗过程中，把治疗作用或药物效应限定在特定的靶细胞、组织或器官内，而不影响其他正常的细胞、组织或器官的功能。三、简单题6.简述酵母双杂交技术的原理及其用途。原理：典型的真核转录因子（的酵母转录因子GAL4）都含有二个结构域：DNA结合结构域BD和转录激活结构域AD，二个结构域功能上相互独立又互相依赖，只有结合才具完整活性。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白蛋白的相互作用。, 将可能存在相互作用的2 种蛋白质，分别和BD/AD 在空间结构上重新连接为一个整体而与报告基因的上游激活序列(UAS) 结合，如果已知蛋白和研究蛋白之间可以形成蛋白-蛋白复合物，使GAL4的2个结构域相互接近,表现出转录因子的活性从而启动转录，使UAS下游启动子调控的报告基因LacZ 得以表达。用途：广泛地应用于蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA、蛋白质与RNA 以及蛋白与其他小分子间相互作用的研究，如今也开始运用该系统进行高通量筛选相互作用蛋白及其他相关分子。可用于发现新基因的主要途径、筛选新的相互作用蛋白、研究抗原抗体相互作用的等方面。10. 根据作用原理生物分子的分离纯化有那几类？（1）根据分子极性大小和溶解度的不同，如溶剂提取技术、盐析法、分配层析法、分级沉淀法等；（2）根据分子形状和大小不同，如凝胶过滤层析等；（3）根据物质吸附性质不同，如选择性吸附与吸附层析法等；（4）根据分子带电性（电离性质）的差异，如离子交换层析、电泳、等电聚焦法等。（5）根据配体特异性，如亲和层析。21.举例说明载体应具备的基本要素。能自我复制并具较高的拷贝数。分子量一般0.99)，这样才能认为实验的过程和数据是可信的，使用这个方程式计算出未知样本的初始模量。实时荧光定量PCR仪都有软件，可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。49.基因诊断常用到的方法有哪些？（1）基因结构异常，针对DNA水平的主要方法有：核酸分子杂交、聚合酶链式反应（PCR）、限制性片段长度多态性分析(RFLPs)、Southern blot、限制性酶切图分析、DNA测序（DS）、DNA芯片等。（2）基因表达异常RNA诊断常用的方法有：Northern印迹杂交、RT-PCR、实时荧光定量PCR。蛋白质水平：Western Blot、组化、酶联接免疫吸附剂测定（ELISA）、蛋白芯片。50.TaqMan技术如何设计引物和探针？（1）TaqMan技术引物设计原则 序列选取应在基因的保守区段； 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，以免引物自身形成环状发卡结构； 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。 Tm值在5565，GC含量在40%60%； 引物之间的TM相差避免超过2； 引物的3端避免使用碱基A，引物的3端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基； 为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子； Taqman探针技术要求片段长度在50bp150bp； 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。 （2）TaqMan探针设计原则 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针； 探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)，以保证结合特异性； 探针的DNA折叠和二级结构；尽量避开二级结构； Tm值在65-70，通常比引物TM值高5-10（至少要5），以确保在退火过程中探针先于引物与目的片段结合，GC含量在40%70%； 探针的5端应避免使用G鸟嘌呤因为5G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用； 整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针； 为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。51.如何对镰刀形细胞贫血和地中海贫血进行基因诊断？（1）镰刀形细胞贫血镰状细胞贫血由链基因点突变引起该病的主要原因是因为珠蛋白的基因发生单一碱基突变，正常基因的第6位密码子为GAG，编码谷氨酸。突变后为GTG，编码缬氨酸，使成为HbS。基于AT的变换，改变了限制性内切酶的位点，因此在酶切正常人DNA和患者DNA后再用标记的珠蛋白基因作为探针作Southern杂交时，就会出现不同的DNA条带。限制性内切酶Mst切割的序列是CCTNAGG，切割正常DNA产生1.15+0.20kb珠蛋白的DNA片段；若切割患者DNA时，由于AT破坏了Mst的位点（CCTGTGG），便形成1.35kb珠蛋白的DNA片段。利用以上原理，可以用PCR-PFLP的技术进行诊断。即用PCR方法将包含待测多态性位点的DNA片段扩增出来，然后用识别该位点的限制酶来酶解，根据限制酶片段长度多态性分析作出诊断。此外还可以使用PCR-ASO探针杂交法对Hbs病进行基因诊断。（2）地中海贫血地中海贫血：基因不同程度的缺失引起不同类型的地贫，基因缺失14个。正常Gene组用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一个 Gene时可得到10kb片段。可利用单管多重PCR( mPCR) 技术、凝胶电泳及DNA测序技术进行A地贫的基因诊断。地中海贫血：地贫是指发生在珠蛋白外显子第654位CT突变（IVS-654，CT）而引起的一种地中海贫血，出现单碱基取代产生了一个新的GT二核苷酸，联同旁侧序列构成一个新的5端异常的剪切位点，同时还激活了IVS-第579位处3端隐匿的剪接位点，从而将IVS-nt579nt652之间的一段73bp的内含子序列作为额外的外显子插入到外显子2和外显子3之间，产生了异常的珠蛋白mRNA。在异常剪接的mRNA中存在一个提前的终止密码子，使翻译提前中止而产生截短的、不稳定的异常珠蛋白，导致正常的珠蛋白合成减少。可利用RT-PCR方法诊断。提取样本RNA 用于进行针对、 和 珠蛋白基因的 FQ RT-PCR 。根据FQ RT-PCR 原理, 设计合成分别对应的引物和荧光探针进行诊断分析。52.杜氏肌营养不良（DMD)的分子诊断原因：DMD（目前已知人类最大的基因）的部分缺失或重复是导致杜氏肌营养不良的主要原因。诊断：DMD/BMD是一种X连锁隐性遗传的神经肌肉系统受累的致死性遗传病，此基因很大，且缺失可发生在不同的部位，因此应尽可能采用多对引物作PCR扩增（多重PCR）来检测。如扩增产物电泳后发现有带纹的缺失，即可作出诊断并对缺失定位。进行产前诊断时，一般可先通过检测家系中有关成员，即确定先证者的却失区，然后又针对性地做PCR扩增，包括缺失部分的两端，但非缺失型不能用此法查出。1.简述基因的分类：基因按其功能可分为：结构基因：可被转录形成 mRNA，并转译成多肽链，构成各种结构蛋白质，催化各种生化反应的酶和激素等。调节基因：某些可调节控制结构基因表达的基因。其突变可影响一个或多个结构基因的功能，或导致一个或多个蛋白质（或酶）量的改变。 如microRNAs, siRNAs, piRNAs 核糖体 RNA 基因与转运 RNA 基因：只转录产生相应的RNA而不翻译成多肽链。2.简述RNA 病毒基因组编码序列的节段性有些病毒的基因组 RNA由不连续的几条核酸链组成（如流感病毒，轮状病毒等）。 分段基因组的病毒一般感染效率较低 ；分段基因组容易发生重组，故病毒容易变异 。目前未发现DNA病毒有此状况。3.简述病毒基因组的结构特点（和功能）病毒基因组可以由DNA或RNA组成； 病毒基因组的大小相差较大；部分RNA病毒基因组编码序列具有节段性；病毒基因存在基因重叠；病毒基因组的大部分序列具有编码功能； 病毒基因组的转录单元是多顺反子病毒基因组都是单倍体； 噬菌体基因具有连续性。4.大肠杆菌染色体基因组的结构大肠杆菌基因组序列中的基因密度非常高，编码区所占的比例较大。而且这些结构基因没有内含子。大肠杆菌DNA分子中的重复序列很少，但在大肠杆菌基因组中不同部位可以有称为转座子的50kb的重复片段。 5.真核生物染色体基因组特点在人类基因组中只有很少一部份（约2-3）DNA序列用以编码蛋白质和结构RNA。人类基因组中存在大量基因间隔区序列，主要由重复DNA构成。在基因内部含大量内含子。（1）真核生物基因组存在大量的重复序列单拷贝序列：结构基因基本上属于单拷贝序列。 中度重复序列：重复次数10105，如rRNA、tRNA、组蛋白以及免疫球蛋白的基因等 高度重复序列：拷贝数大于106 ，如反向重复序列和卫星DNA。重复序列的多态性：DNA多态性指的是DNA 序列发生变异从而导致的个体间核苷酸序列的差异。主要包括：单核苷酸多态性（SNP）和 串联重复序列多态性。（2）真核基因组存在多基因家族与假基因多基因家族：由某一祖先基因经过重复和变异所产生的一组基因。多基因家族大致可分为两类：一个基因家族的不同成员成簇地分布在不同染色体上，但核酸序列高度同源，编码一组功能上紧密相关的蛋白质，如珠蛋白基因家族；基因家族成簇地分布在某一条染色体上，它们可同时发挥作用，合成某些蛋白质，如组蛋白基因。假基因：与某些有功能的基因结构相似，但不能表达有功能的基因产物的某些基因。假基因的产生有两种方式：由突变引起的基因序列变化而失去功能，这样产生的假基因带有内含子，称为常规假基因；mRNA经过反转录为cDNA，再插入基因组，由于插入位点不合适或序列发生变化而导致失去功能。这种类型的假基因不含内含子，称为已加工的假基因。7.简述生物分子的主要特征1）结构复杂有序、具有特殊的层次； 2）行使专一的功能；3）代谢是其存在的条件； 4）生物分子体系具有自我复制的能力；5）能人工合成与改造。8.生物大分子的制备的主要特点（1）分离纯化方法千差万别，没有一种标准方法可通用于各种生物大分子的分离制备；（2）制备几乎都是在溶液中进行的，难以准确估计和判断pH值、温度等各种参数对溶液中各种组份的综合影响；（3）大多数生物大分子的含量极微，分离纯化的步骤多，流程长，有的目的产物甚至要经过几十步的操作才能达到所需纯度；（4）分离纯化过程中要保证目标产物的活性。9.生物大分子制备的一般步骤： （1）确定制备的目的和要求，一般为科研、开发或发现新的物质（2）建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备的关键，要求：特异性强准确度高灵敏度高使用快捷方便 （3）文献调研和预备性实验，这需要掌握目的（4）材料的破碎和预处理（5）分离纯化方案的选择和探索，这是大分子制备最困难的过程（6）产物纯度的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰（7）产物的浓缩，干燥和保存。11.对于核酸的纯化应达到的要求： 1）核酸样品中不存在过高浓度的金属离子和对酶有抑制作用的有机溶剂； 2）其它生物大分子如蛋白质、脂类和多糖分子的污染应降至最低程度； 3）排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，提取RNA分子时应去除DNA。12.如何保持核酸的完整性 在整个操作过程中应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏。 1）温度不要过高(04)；(高温破坏氢键) 2）控制pH值范围(pH值4-10);(极端酸碱破坏磷酸二酯键) 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.13.简述核酸的保存(1) 对DNA DNA样品溶于pH8.0的TE，4 或-20 保存；在-70可保存数年 长期保存样品中可加入1滴氯仿。(2) 对RNA RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70 保存; 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; 在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70,可保存数年。14.简述真核基因组DNA分离纯化的一般技术路线（1）预处理：对生物样本进行组织粉碎和细胞裂解，以使得DNA释放、蛋白沉淀降解。（2）分离：可采用酚抽提法、甲酰胺解聚法、玻棒缠绕法、异丙醇沉淀法，获得基因组DNA粗品。（3）纯化：可采用透析、层析、电泳（包括PAGE、AGE、PFGE）、选择性沉淀等方法获得特定的DNA片段，再经过柱层析或有机溶剂抽提、沉淀、洗涤获得基因组DNA纯品。15.酚抽提法中裂解液的主要成分及作用EDTA：离子螯合剂，抑制DNase活性，降低细胞膜稳定性SDS：溶解细胞膜、核膜，乳化脂质、蛋白，并使其变性沉淀，同时变性DNase无DNase的Rnase：可高效水解RNA而避免DNA的消化蛋白酶K：消化DNase和胞中的蛋白质酚：变性沉淀蛋白，抑制DNase活性pH 8.0的Tris溶液：保证抽提时DNA进入水相，防止DNA变性16.简述质粒DNA碱裂解法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。17.概述核酸分离、纯化（1）蛋白质的去除：酚/氯仿抽提；使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）；高盐洗涤；蛋白酶处理（2）多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖；用多糖水解酶将多糖降解；在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖；用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。（3）多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等；加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合（4）盐离子的去除：70的乙醇洗涤18.蛋白质分离纯化的总目标增加制品的纯度或比活，以增加单位蛋白质重量中靶蛋白的含量或生物学活性（比活常以活力单位数/毫克蛋白质表示），即从蛋白混合物中设法去除不要的杂蛋白和变性的靶蛋白，使靶蛋白的产量达到最高值。19.举例说明蛋白质的分离纯化方法盐析法：将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 等电点沉淀法：净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。该法适用于在等电点pH稳定的蛋白质。有机溶剂沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（保持低温），破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。20.凝胶过滤层析的机理凝胶色谱的机理是分子筛效应，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。因此，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。22.简述载体的分类。（1）克隆载体：能将载体外源DNA在受体细胞中复制、扩增并产生足够量目的DNA的载体。包括质粒载体、噬菌体载体（2）表达载体：是指能将外源基因在受体细胞中有效转录和正确翻译的载体。原核表达载体包括非融合型表达载体、分泌型表达载体、融合型表达载体：（3）穿梭载体：人工构建的既带有原核细胞的复制元件、又带有真核细胞的复制元件，既能在原核细胞中复制、又能在真核细胞中复制，在原核和真核细胞分子克隆中均能应用的载体称为穿梭载体。23.粘粒载体的特点粘粒载体大小为46Kb，而插入外源基因长达4050kb。加入l噬菌体头部和尾部蛋白，可将粘粒包装成类似于l噬菌体的具感染能力的颗粒，容易进入大肠杆菌。粘粒进入细菌后则完全失去噬菌体的功能，而表现质粒的特性。26.变性DNA的理化性质（1）溶液黏度降低：DNA双螺旋是紧密的“刚性”结构，变性后代之以“柔软” 无规则单股线性结构，DNA黏度明显下降。（2）溶液旋光性发生改变：变性后DNA分子的对称性及局部构型改变。（3）紫外吸收增加：DNA变性后，DNA 溶液的紫外吸收增强。双链DNA单链DNA单核苷酸27.简述核酸变性Tm的影响因素（1）DNA分子大小和碱基的组成（G+C含量）DNA片段小的比大的容易变性，Tm值低；在溶剂固定的前提下，Tm值的高低取决于DNA分子中的（G+C）的含量。当核苷酸20bp有Tm=4（G+C）+2（A+T）。（2）溶液的离子强度溶液中离子与DNA分子中磷酸基团形成离子键，需要较高温度才能使DNA变性。离子强度较低时，Tm值较低，而且解链的温度范围也较宽。（3）pH值pH值影响氢键的形成。pH值在5-9范围内，Tm值变化不明显。pH值小于4或大于11时，均不利于氢键的形成，DNA容易变性。（4）变性剂干扰碱基堆积力和氢键的形成，因此可以降低Tm值。常用的变性剂有甲酰胺、尿素、甲醛等。 28.核酸复性的影响因素（1）温度和时间一般认为比Tm低25左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢。复性时温度下降必须是一缓慢过程。（2）DNA浓度DNA复性的第一步是两个单链分子间的相互作用“成核”。“成核”速度与DNA浓度的平方成正比。溶液中DNA分子越多，相互碰撞结合“成核”的机会越大。（3）DNA分子大小和复杂度DNA片段越大，扩散速度越慢，复性速率较慢；DNA浓度越高，复性速度越快。（4）离子强度增加盐浓度可增加互补链合成双链的速度，盐中和DNA单链中磷酸基团的负电荷，减少互补链静电排斥。29.简述核酸探针的类型（1）基因组DNA探针来源：这类探针来源于某种生物的基因组，多为某一基因的全部或部分序列。 制备方法：基因克隆的方法、聚合酶链反应(PCR) 特点：多克隆在载体中的DNA片段，可无限繁殖，取之不尽。PCR制备探针简便和省时。相对RNA而言，DNA探针不易降解，标记方法也较成熟（2）cDNA探针特点：不存在内含子和高度重复序列，是一种较理想的核酸探针，尤其是用于基因表达的研究。 排除了RNA酶的影响，现已成为分子生物学实验室的常规实验。 （3）RNA探针RNA探针与靶序列的杂交效率较高，稳定性也高。RNA分子中不存在高度重复序列，非特异性杂交少，杂交后未杂交的探针分子水解可用RNA酶去除，本底的干扰低。RNA探针有易降解和标记方法复杂等缺点，限制了其广泛应用。 （4）寡核苷酸探针特点：根据需要来合成相应的核酸序列，避免天然探针的缺点。探针长度一般为1050bp。 尤其适合点突变的检测。 由于探针的长度较短，特异性较低，杂交信号较弱 ，但经过精心设计仍可设计出非常特异的寡核苷酸探针。 30.寡核苷酸探针设计原则：（1）探针长度：一般要求在1050bp。 （2）GC含量为4060。 （3）探针分子中应避免互补序列。 （4）避免同一碱基连续出现，一般不能多于4个，如GGGG-或 -CCCC-。 （5）借助计算机相应软件与已知的各种基因序列进行同源性比较。 31.理想的探针标记物的特点：检测物要灵敏、特异、稳定、简便。标记物与探针结合后，应不影响杂交反应，尤其是杂 交特异性、稳定性和Tm值。标记物对环境污染小，对人体无损伤，价格低廉。标记物对检测方法无干扰。 33.分子杂交技术一般流程探针制备及标记（同位素或非同位素） 待测核酸样品制备（分离，纯化）杂交（液相，固相，原位杂交）杂交后处理（去掉非特异杂交分子）显示结果（显色，发光，放射自显影）结果分析34.固体杂交的优点及类型：固相分子杂交：是将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，然后放入含有标记探针的杂交液中，进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，故称固体杂交。未杂交的游离探针通过漂洗可容易除去，膜上的杂交分子容易检测，还能防止靶DNA的自我复性，所以被广泛应用。（1）Southern印迹杂交DNA变性；中和；Southern印迹；预杂交；杂交；洗膜；检测 （2）Northern印迹杂交Northern印迹杂交是应用DNA探针检测特异mRNA的一种膜上印迹技术。用于分析mRNA分子大小及mRNA的转录情况（3）斑点杂交斑点杂交是将待检样品（DNA、RNA 或细胞）直接点到膜上，烘烤固定。斑点杂交不需电泳和转膜过程，整个操作过程简便、快速。但结果无法判断核酸片段的大小，也无法判断样品溶液中是否存在着不同的靶序列。多用作核酸定性或半定量分析，而且便于杂交条件的摸索。（4）菌落杂交（5）微板酶联杂交捕获探针共价结合在微孔板上，不仅结合牢固而且结合量大，因而捕获能力很强。捕获探针竖直地而不是平躺地“包被”在微孔板表面，因而与目的片段的杂交效率很高。检测探针5端、3端均标记生物素，等量检测探针结合亲合素-辣根过氧化物酶的量增加35.Northern与Southern印迹杂交的不同点RNA提取过程中需特别注意RNA酶的污染。所用器材最好与Southern印迹实验分开使用。RNA变性的方法：不能用碱变性，因为碱会水解RNA的2-羟基基团，在变性剂的存在下进行电泳，防止RNA分子形成发夹式的二级结构，以保持其单链线形状态。印迹前将含变性剂的凝胶用水冲洗掉，再印迹、杂交。如果测定RNA片段大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照像，样品胶则进行Northern转印。36.原位杂交的应用O正常或异常染色体的基因定位。应用核酸探针与细胞内RNA进行杂交用于检测该组织细胞中特定基因表达水平。应用特异的病原体核酸作为探针对组织、细胞进行杂交，以检测有无该病原体的感染等。37.原位杂交基本流程细胞或组织切片的处理：玻片清洗、组织和细胞的固定增强组织的通透性和核酸探针的穿透性预杂交 杂交 杂交后漂洗 结果检测38.简述PCR的特点：PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。通过体外（试管内）扩增，可以将目的基因（或靶基因）片段百万倍的放大，从而达到极大地提高核酸分子检测的灵敏度，理论上其检测的灵敏度可以达到一个细胞、甚至一个分子的水平。 40.PCR buffer成分及功能:一般组成：50mM KCl, 10-50mM, Tris-Cl (室温PH8.3) ，1.5mM MgCl2 KCl：促进引物退火，高浓度KCl抑制Taq DNA聚合酶活性；Tris-Cl：调节pH值，使反应体系偏碱性；MgCl2 ：调节Taq DNA聚合酶活性、影响引物退火，PCR产物的特异性等42.TaqMan探针工作原理5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等3端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有53外切核酸酶活性，可水解探针，每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号43.简述SYBR Green ISYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光（ SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位）变性时，DNA双链分开，无荧光在延伸结束阶段采集荧光信号。SYBR Green 也能和非特异的双链DNA结合发光，所以必须在反应结束时做熔解曲线分析44.代谢组学的特点：1.关注于内源性小分子化合物。2.对生物体系中的小分子化合物进行定性定量研究。3.内源性小分子化合物的上调和下调指示了与疾病、毒性、基因修饰或环境因子的影响。4.内源性化合物的特点用来表征疾病和药物筛选。45.MicroRNA的特征和功能特征：广泛存在于真核生物中, 是一类内源性表达的非编码短序列RNA, 本身不具有开放阅读框 (ORF) ； 成熟的miRNA长度通常为2125nt； miRNA在进化上具有高度保守性； miRNA表达具有细胞和组织特异性，同时具有时序性 功能：miRNA通过基因的转录后调控过程参与了生命体的发生、生长、发育、分化和死亡的各个过程。如线虫幼虫发育阶段的转换，哺乳动物的造血分化，脂类代谢，激素分泌，癌症，糖尿病，白血病以及病毒感染等。 46.Ct的意义（1）确定初始模板的浓度初始 DNA量越多, 荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量（2）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。47.感染性疾病分子诊断的策略：（1）一般策略：针对特异性的核酸序列进行核酸分子探针杂交，或者利用PCR技术直接检出微生物的DNA/RNA，来判断有无感染或何种病原体。（2）完整策略：通过分子生物学技术手段对病原体DNA/RNA进行序列分析，作出明确诊断，并对其进行分类、分型和耐药性进行鉴定。基因序列测定是诊断感染性疾病的黄金标准。诊断分型亚型耐药性48.基因结构异常： 异常血红蛋白（镰状细胞贫血） 镰状细胞贫血由链基因点突变引起该病的主要原因是因为珠蛋白的基因发生单一碱基突变,正常基因的第6位密码子为GAG,编码谷氨酸,突变后为GTG,编码缬氨酸,使成为HbS.诊断：限制酶切片段电泳后，经Southern Blot检测ASO探针诊断：已知突变Gene部位和性质，合成寡核苷酸探针，32P标记，进行Southern Blot 杂交/斑点杂交。（正常探针和突变探针）53.肿瘤的分子诊断（1）通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤如淋巴造血系统肿瘤，.用PCR扩增通过长度分析就能判断是否发生了基因重排.（2）通过检测癌基因和抑癌基因诊断肿瘤癌基因的激活及抑癌基因的失活与肿瘤的发生密切相关.大多人类肿瘤组织或细胞中都能检测到癌基因和(或)抑癌基因的突变ras癌基因点突变检测方法a.PCR-ASO法 b.PCR-SSCP法P53基因检测方法：a.PCR-SSCP b.PCR-RFLP（3）通过检测肿瘤相关病毒诊断肿瘤（4）通过检测肿瘤标记物基因或mRNA诊断肿瘤肿瘤标志物是由肿瘤组织细胞产生的，与肿瘤形成和发展相关的物质，包括：肿瘤抗原，激素，酶和同工酶。仅存在肿瘤细胞中。类型：基因标志：是指基因本身突变和异常表达，能反映癌前启动阶段的变基因表型标志：基因产物表达和调控异常，表现为所编码的表达产物合成紊乱，产生胚胎性抗原，一般出现较晚。 基因诊断方法： 基因变异导致肿瘤标记物的产生或含量改变，可选择：PCR-RFLP,PCR-ASO,PCR-测序，PCR-SSCP等技术。 导致肿瘤标记物产生或含量改变分子机制不清楚，可用RT-PCR技术检测肿瘤标记物mRNA的存在或含量的改变。如：端粒活性酶活性被用来作为肿瘤标记物，在肿瘤细胞中该酶的活性增高。54.基因治疗的必备条件：1. 分子缺陷清楚 2. 可以得到相应基因的克隆3. 病理生理机制已知 4