干细移植ppt课件

干细胞移植,自体外周血干细胞和骨髓干细胞联合移植治疗 DM-PAD的临床研究,河南省人民医院,河南省卫生厅科技攻关项目,研究的任务来源,DM-PAD的病理基础 外周血管的动脉粥样硬化，随着糖尿病病程的延长，形成慢性闭塞性病变，组织缺血缺氧而溃烂感染，严重患者不得不截肢而致残。,概 念,DM-PAD,背 景,15,510,50,DM-PAD 几个值得关注的数字,1.5亿,DM-PAD 的危害,三部曲： 溃疡 截肢 死亡,糖尿病足的自然结局,干细胞移植 治疗技术?,DM-PAD的治疗,内科保守治疗 搭桥术 介入治疗,盲区！,评价疗效: 自体外周血联合骨髓干细胞移植治疗DM-PAD的临床疗效 开发技术: 内皮祖细胞鉴定技术 临床疗效的客观评价标准,研究目的,静息痛或/和麻木、冷感、间歇跛行、治不愈的缺血性溃疡 患肢检测Po250mmHg 患肢检测ABI（ankle-branchial pressure inder）0.9,两次检测间隔时间不少于1周 动脉管腔狭窄不适于进行血管搭桥、介入、手术治疗 本组所有对象或对象家属均对干细胞移植治疗知情同意，自愿接受该治疗，术前签字。,研究对象,A: 控制不良的DM(Diabetes mellitus) B: 增殖性视网膜病 C: 过去5年中有恶性疾病史患者 D: 心脏，肾脏等功能不能接受造影者,不适于自体干细胞移植,干细胞移植治疗组 99例DM2-PAD 内科综合治疗+ 干细胞移植 对照组 95例DM2-PAD 内科综合治疗,分 组,本组例数9 9例， 男56例，女43例。 糖尿病病程1个月至26年。 平均年龄（696）岁，年龄范围5681岁。本组99例患者中95例患者双侧肢体自体干细胞移植， 1例在入院时前1年（2002年）行左下肢截肢术， 3例仅缺血较重的一侧肢体自体干细胞移植，1例一侧肢体截肢患者另一侧肢体干细胞移植，干细胞移植的肢体为194条。 3例曾行下肢血管搭桥手术，4例血管内支架置入术，术后1个月1.5年再次闭塞。 合并高血压者59例。 合并陈旧性脑梗死者34例。,糖尿病足的自然结局,194个接受干细胞移植的肢体中： 疼痛：106个（55%），止疼剂57例（58%）； 冷感：181个（93%）； 麻木感：123个（63%）； 间歇跛行：64例（65%） 皮肤暗红：156个（63%）； 皮肤溃疡：89个（46%）； 坏死：37个（19%）； 感染：19个（10%）。,足背动脉搏动： 178个肢体未能触及足背动脉搏动，19个肢体足背动脉微弱。 彩超检查： 本组均发现下肢各段动脉不同程度的狭窄或闭塞，足背动脉全部闭塞。 DSA造影： 23例行DSA造影，1例全髂外动脉闭塞经动脉内留置导管溶栓后置入支架。股动脉狭窄或闭塞11例，全部患者腘动脉以下流出道狭窄和（或）闭塞并且罕见侧支的建立。 双向多普勒（美国Versalab SE）： 全部患者血流波幅减低，ABI 0.230.76，平均0.46。 经皮PO2测定（日本9100型）：足背部PO2 05.3kPa, PCO2 5.67.9kPa。 日本多功能红外线检测仪：足背部温度2333，平均27.4，与体表温度相差34。 美国感觉检测仪：足部深感觉全部患者减退或消失。,糖尿病足的自然结局,自体干细胞移植组和对照组患者一般资料具有可比性，无统计学意义。 对照组治疗采用内科综合治疗：控制血糖、血压，给予活血化瘀及改善微循环药物治疗，足部溃疡定期局部换药及清创治疗。 自体干细胞移植组与对照组患者一般资料表 项 目自体干细胞移植组对照组人数（肢体数）99（194）95（180）性别男/女56/3853/42年龄（岁）696687病程（年）100.79.90.6合并高血压者5954合并陈旧性脑梗死者3429合并冠心病者2623 疼痛的下肢数106（55%）101（56%） 冷感的下肢数181（93%）165（92%） 麻木感的下肢数123（63%）113（63%） 足部皮肤暗红的下肢数156（63%）146（77%） 足部皮肤溃疡的下肢数89（46%）82（43%） 足部坏死的下肢数37（19%）35（19%） 足部感染的下肢数19（10%）19（10%） 间歇性跛行的下肢数60例（62%）61（62%） 检验， P0.01认为差异有统计学意义。 2检验，P0.01认为差异有统计学意义。,糖尿病足的自然结局,5. 结果 5.1 99例194个肢体干细胞移植前后效果评价: 99例194个肢体移植后2周后，疼痛症状明显缓解、好转、无效的肢体分别为94个（48.95%）、 96个（49.95%）、无效4个（2.1%）。 对照组分别7个（3.7%）、156个（81%）、27个（15.3%），经2检验2组间显效率及无效率差异均有统计学意义（分别为2 =99.26，P0.01；2 =19.09，P0.01）。 5.2 冷感明显缓解、好转、无效的肢体分别为126个（64.9%）、 63个（32.5%）、无效5个（2.6%）。,糖尿病足的自然结局,对照组分别为6个（2.6%）、158个（83.7%）、26个（13.7%），经2检验2组间显效率及无效率差异均有统计学意义（分别为2 =199.91，P0.01；2 =8.62，P0.01）。 5.3间歇性跛行明显缓解、好转、无效的肢体分别为138个（71.2%）、 47个（24.2%）、无效9个（4.6%）。 对照组分别为13个（7.6%）、152个（79.2%）、25个（13.2%），经2检验两组间显效率及无效率差异均有统计学意义（分别为2 =162.4，P0.01；2 =15.95，P0.01）。,糖尿病足的自然结局,5.4 移植后2周症状体征改变情况： 移植后足部冷感、疼痛、间歇跛行有显著好转或消失，其中以冷感缓解最快。37条患肢移植后1周足趾溃疡处有渗出，413周溃疡开始好转。 13例足趾坏疽患者移植后3个月足部坏疽界限清晰自行脱落，创面愈合良好。 5.5 移植1个月检测100%患肢皮温不同程度改善。 5.6 术后2和4周93%患足经皮测定氧分压增加和二氧化碳分压下降。 5.7 移植后1个月检测134例患者足部血流波幅较移植前增加，ABI改善。 5.8 2例患者移植后2个月复查血管造影，可见新生血管形成。 5.9 追踪病历 自体干细胞移植后满2年者26例，满3年者12例，症状持续缓解，间歇跛行消失。 移植后无效的病例4例。指的是移植疼痛、麻木、冷感及间歇跛行均无改善者。,糖尿病足的自然结局,方法： 1根据糖尿病及糖尿病足诊断标准选择99例糖尿病足患者进行研究，同时选95例对照。 2外周血干细胞的动员和分离: 对移植组进行外周血干细胞动员，每天给予rhG-CSF450u-600u，皮下注射，第6天用COBE6.1血细胞分离机单采单个核细胞（MNC），总量60-120ml。 3骨髓干细胞的抽取和分离: 于外周血干细胞动员的第5天，局部麻醉下从骼骨处抽取自体骨髓血200mL，在实验室将骨髓沉淀、离心，分离等处理后制备40mL干细胞悬浊液备用。 4内皮祖细胞鉴定 5干细胞悬液的配制: 将2种干细胞悬液混匀，配成（19）108L-1浓度的悬液。 6将悬液按3cmx3cm距离进行缺血肢体移植术，移植后观察各项指标变化，进行综合评估。,糖尿病足的自然结局,结果显示： 1移植后大多数患足足部疼痛、冷感、间歇性跛行有显著好转，其中以疼痛缓解最快。与对照组比，经2检验2组间显效率及无效率差异均有统计学意义。 2移植1个月检测大多数患肢皮温改善。 3术后2和4周多数患足术后经皮氧分压增加和二氧化碳分压下降。 4移植后1个月检测患者足部血管搏动图波幅较移植前增加，ABI改善。 5移植后12个月复查血管造影，可见新生血管形成。 6所有患者顺利完成未出现并发症和不良反应。,糖尿病足的自然结局,结果表明： 1移植前“土壤”准备：移植前期改善一般情况、局部微循环很重要。 2种植的干细胞数量要足够，干细胞数量1109个。 3围移植期及术后控制血糖、血压，改善微循环，局部创面处理等很关键。,糖尿病足的自然结局,糖尿病足的自然结局,技术关键： 1. 外周血、骨髓干细胞干细胞的分离和提取； 2. 内皮祖细胞鉴定技术 3. 干细胞的种植； 4. 种植前后下肢的各项指标变化观察的客观方法。,先进性： 1. 内皮祖细胞鉴定技术 2. 诱导后的外周血分离出的干细胞移植联合骨髓干细胞 3移植例数多、安全、效果好 4评价方法客观,创新点： 1诱导后的外周血分离出的干细胞移植联合骨髓干细胞，解决了“种子”问题，国内外常用的单行骨髓取干细胞不能达到足够的干细胞数量。此方法属于国内首创。 2先进客观的检测方法，经皮PO2测定，ABI及动脉搏动图检查，DSA造影评价新生血管生成，较完善的检测技术。 3内皮祖细胞鉴定技术,小结 1本研究国内首次采用糖尿病患者经动员后的自体外周血干细胞和骨髓干细胞联合移植治疗糖尿病足，解决了“种子”问题。干细胞在缺血的下肢组织内分化成内皮细胞，继而局部血管新生。 2例数多，疗效好，安全性高。形成了完整的技术体系，积累了一定的临床经验。 3检测技术完善，评价方法客观。 4国内外相关研究尚属初级阶段，开展很少，本研究在国内处于先进水平。 自体干细胞移植治疗糖尿病足由于具有取材方便，自体来源无免疫排斥，能在体外扩增并进行基因修饰等特点，在糖尿病患者肢体缺血的治疗，再建糖尿病患者的血管形成等方面有广阔的应用前景。,自体干细胞移植方法,外周血干细胞采取 经G-CSF动员后，用血细胞分离机采取 和分离单个核细 胞，并将其中部分干细胞冻存于液氮备用 骨髓干细胞采取 在全麻条件下分别从骼骨及胸骨处抽取骨髓约500ml，然 后在血细胞分离机上分离单个核细胞备用。 自体干细胞移植 在手术室严格无菌条件下操作，将制备好的自体干细胞 （108/ml)植入患肢肌肉, 一个肢体约40个点。,移植前一周检测一次：临床指标、皮温、 ABI 、 PO2 、双下肢动脉血流速度、 DSA。 移植后每周检测1次：临床指标、皮温、 ABI 、 PO2 、双下肢动脉血流速度。移植4周、 3月分别DSA造影检查。,评价项目,1. 疼痛 0 分：无疼痛 1 分：偶有疼痛，被问时能回忆起 2 分：疼痛经常出现，但能耐受，不需或偶用 一般止痛剂 3 分：经常用一般止痛剂 4 分：因疼痛影响睡眠，一般止痛剂难以缓解,临床疗效评价指标,2. 患肢冷感 0分：无冷感 1分：偶述患肢有发凉怕冷的感觉 2分：受累肢体经常有发凉怕冷的感觉 3分：患肢有明显的冷凉感觉，需采用局部 保温措施，症状得到一定程度的缓解 4分：受累肢体有明显的冷凉感觉，采用局 部保温措施，症状亦无明显缓解,临床疗效评价指标,3. 下肢间歇性跛行: 速度6070m/min行走，无坡度 0分：行走500m无疼痛 1分：行走400499m有疼痛 2分：行走300399m有疼痛 3分：行走100299m有疼痛 4分：静息痛，无法行走或行走100m有疼痛,临床疗效评价指标,SDW数字点温仪测皮温： 测量时室温应前后一致 0分：皮温升高1.5度 1分：皮温升高1.5度 2分：皮温升高1.0度 3分：皮温升高0.5度 4分：皮温不变,辅助检查疗效评价,ABI：踝动脉压/臂动脉压。可用肢体血流仪检测。 正常人应1，ABI增加0.1开绐作为判断有效的指标. 双下肢血流灌注改变,肢体血流检测仪,辅助检查疗效评价,肢体血流检测仪测定ABI再现性,经皮PO2 ，Pco2检测： 正常人PO2 50mmHg, Pco240mmHg 。 检测时，患者体位、室温、检测位点及检测点的皮温均应一致。,DSA观察侧枝血管形成 0分：无新生侧枝血管 1分：少许新生侧枝血管（移植的总长度的1/3 范围内有新生血管）。 2分：中量新生侧枝血管（移植的总长度的2/3 的范围内有新生血管）。 3分：丰富新生侧枝血管（移植的范围内均有新 生血管）。,辅助检查疗效评价,胚胎干细胞发育路径,1997，Asahra首次成功分离出内皮祖细胞，并证实内皮祖细胞（EPC，endothelial progenito cells）源于骨髓干细胞，在循环血中有这种起源于骨髓的EPC。循环EPC担负着出生后生理性（如子宫内膜血管生成，组织炎症部位新生血管形成）新生血管形成重任及病理性（如肿瘤、风湿性关节炎）新生血管形成。,自体干细胞移植治疗DM-PAOD可能性,治疗性血管生成（therapeutic angiogenesis）是近2年提出的一种新的治疗方法，可以通过以下方式实现： 应用促血管新生生长因子bFGF(basic fibroblast growth factor)、VEGF(vascular endothelial growth factor)等，或编码此类蛋白质的基因；两种方法由于存在致癌性，非靶向治疗部位血管新生等缺陷，不适于临床应用。 2. 自体成体骨髓干细胞（autologous adult bone-marrow stem cells）移植。,自体干细胞移植治疗DM-PAOD可能性,多个研究小组的动物实验证实，将骨髓单个核细胞植入梗死心肌或缺血肢体可促进局部的血管形成建立新的侧枝循环，并肯定了植入的EPC参与了新的小血管和毛细血管的生成。,自体干细胞移植治疗DM-PAOD可能性,机制：可能为在移植局部提供EPC，CD34单个核细胞在局部分泌多种促血管新生生长因子（如bFGF,VEGF等）及局部缺血缺氧的微环境因素刺激，生成新的小血管和毛细血管。,自体干细胞移植机制研究,Tateishi-yuyama等于2002年11月在国际上首次报道了应用成体骨髓干细胞移植成功治疗周围血管病患者的临床报道。,自体干细胞移植治疗DM-PAOD机制,自体干细胞移植治疗DM-PAOD可能性,近年来随着对各种成体干细胞生物学特性认识的不断深入以及分离纯化这些干细胞手段的不断改进，使采用干细胞移植等治疗性血管生成方法在缺血，梗死部位重新建立有效的侧枝循环成为可能。这些研究也表明应用成体细胞移植的治疗性血管生成技术治疗下肢缺血性疾病的一种极具前途的新治疗手段。,1种子要种植在“肥沃的土壤”里。糖尿病下肢动脉闭塞症时局部往往有炎症或水肿，血糖不稳定及低蛋白血症等，要给予纠正，改善局部状况，尽可能把种子洒在肥沃的土壤里有利于干细胞的分化及增殖。 2种植的干细胞数量要足够。目前，临床干细胞移植治疗下肢血管病变有两种方法：自体外周血干细胞移植和单独自体骨髓干细胞移植。有些患者