煤层环境中微生物群落结构及其增产煤层气作用机理研究-毕业论文

本 科 毕 业 设 计（论文）题目：煤层环境中微生物群落结构及其增产煤层气作用机理研究学生姓名： 学号： 专业班级：材料物理 指导教师： 20XX年 6 月 16 日中国石油大学（华东）本科毕业设计（论文）煤层环境中微生物群落结构及其增产煤层气作用机理研究摘要本文从微生物群落结构分析、煤层气增产效果分析以及微生物对煤组分和结构的影响三方面研究了微生物增产煤层气的作用机理。首先采用高通量测序技术分析了煤层环境中菌群种类和丰度；其次采用气相色谱法和气体同位素判定法分析了煤层气的组分和种类；最后采用元素分析法、红外光谱法、X 射线衍射法和压汞法分别研究了微生物对煤样元素的种类和含量、官能团种类、微晶结构和孔隙率的影响。研究结果表明，煤层微生物中的优势菌种（细菌和古菌）能够产生以甲烷为主的生物成因气，且微生物的代谢作用使煤中碳含量下降、含碳官能团含量下降，孔隙率增大。该研究能够为微生物增产煤层气技术的现场应用提供理论指导。关键词：微生物群落；煤组分；煤结构；生物成因煤层气中国石油大学（华东）本科毕业设计（论文）The research of microbial community structure and its mechanism of producing coaled methane in coal seamAbstractThis article carried out the research on mechanism of microorganism producing coaled methane (CBM) in three aspects, including the analysis of microbial community structure, the effect of increasing production of CBM, and the microbial influence of the component and the structure of coal. Firstly using high-throughput sequencing technology analysed the species and abundance of bacterial communities in the coal seam; Secondly using gas chromatographic and gas isotope determination method analysed composition and species of CBM, respectively; Finally this article adopted Elemental Analysis, Infrared Spectrometer (IR), X-ray Diffraction (XRD) and Mercury Porosimetry Analysed the microbial effect on the type and content of coal element, the type of functional group, the microcrystalline structure and the porosity. The results showed that, the main bacteria and archaea in coal seam can produce biogas which is mainly composed of methane, and microbial metabolism decreased carbon functional group levels and increased the porosity of coal seam. The study can provide a theoretical guidance for the field application of microorganism producing CBM technology.Keywords: Microbial communities；Coal composition；Coal structure；Biogenic coalbed methane中国石油大学（华东）本科毕业设计（论文）目录第 1 章前言.11.1微生物增产煤层气概述 .11.1.1微生物增产煤层气的定义 .11.1.2微生物增产煤层气的机理 .11.2国内外煤层气研究现状 .41.2.1国内现状 .41.2.2国外现状 .41.3本文研究背景及研究内容 .5第 2 章煤层环境中微生物群落结构分析.72.1实验方法 .72.1.1基因组 DNA 的提取与纯化.72.1.2菌群种类和丰度测定 .92.2实验结果分析 .102.2.1基因组 DNA 分析.102.2.2群落种类和丰度分析 .112.3本章小结 .15第 3 章微生物增产煤层气的机理研究.163.1增产煤层气效果分析 .163.1.1气体组分分析 .163.1.2气体同位素分析 .223.2微生物对煤组分和结构的影响 .233.2.1煤样品组分分析 .233.2.2煤样结构分析 .273.3本章小结 .30第 4 章结论.32致 谢.33中国石油大学（华东）本科毕业设计（论文）参考文献34第 1 章 前言第 1 章 前言煤层气是一种以甲烷为主要成分的天然气体，又称煤层甲烷，是煤的伴生矿产资源，一般吸附在煤层表面，少数分布于煤孔隙或溶解在煤层水中。由于煤层气是一种洁净能源，且具有气体轻、埋藏浅以及易于开采、经济价值高等特征，近年来在国际上受到科研人员的广泛关注。我国的煤炭资源十分丰富，采煤的同时伴随着煤层气的释放，因此煤层气储量也十分可观，总量位居世界第三。然而由于我国煤体结构复杂，煤体构造破坏严重，占煤层气资源量半数以上的“软煤”普遍发育，其渗透率仅有(10-3-10-4)10-3 m2 数量级1-2，严重制约了我国煤层气产业的发展，因此亟需探索全新的煤储层增透技术。由于煤层气按成因可分为生物成因煤层气和热成因煤层气，因此目前人们对利用微生物降解煤生成甲烷这一观点逐渐达成共识，即只要温度、压力、pH 值、Eh 值、矿化度和营养物质满足微生物的生长要求，就可以把煤转化为以甲烷为主的气体3-7，且微生物的代谢速度与煤颗粒大小成反比，颗粒越小产气效果越好8。美国粉河盆地的煤层气开发表明微生物对煤的转化可以获得持续的煤层气资源9，澳大利亚 Apex 公司提出向煤层中注入甲烷菌可以刺激生物气的生成10。这表明利用微生物对煤层气进行开发和利用具有重要的意义。1.1 微生物增产煤层气概述1.1.1 微生物增产煤层气的定义微生物增产煤层气的概念首先由 Scott 提出11。他指出，在煤层中注入厌氧微生物种群，然后加入微生物生存所需的有机物，微生物就能够将煤逐步降解，从而产生甲烷来达到增产煤层气的效果。而且这一技术不仅能够增加煤层气的产量，煤层的渗透性也能通过微生物的降解作用来增加，从而解决煤层气开采困难的问题。1.1.2 微生物增产煤层气的机理微生物增产煤层气的机理是煤层中的微生物在一定的条件下，通过降解煤产生以甲烷为主的气体。煤是大分子化合物，一般来说，生成甲烷的过程可以用传统生物气产生的机理解释，即首先生成酸，然后产氢，最后生成甲烷，如图 1-11第 1 章前言所示。但是相对于普通的大分子有机物，煤分子中含有氧、氮、硫等元素，是复杂的碳水化合物，其中含有大量的杂环、苯环和脂环，结构更加紧密，微生物作用时产生甲烷的难度更大。图 1-1 复杂有机质厌氧发酵产甲烷的代谢途径示意图因此 Strapo 总结出了微生物通过降解煤从而增产煤层气的可能途径。降解过程首先是煤大分子结构分解为小分子片段，即煤分子中共价键的断裂或是官能团的破坏；然后在多种微生物的共同相互作用下生成中间代谢产物；再经过微生物的发酵作用后，将中间产物转化为生成甲烷所需要的底物，从而被产甲烷菌利用生成甲烷12。2第 1 章前言图 1-2 煤的生物降解过程及中间产物具体过程如图 1-2 所示，“路径 1”为煤样经过微生物处理过后，煤样被降解为复杂芳烃有机物、聚合物及单体化合物，其中这些复杂芳烃有机物、聚合物及单体化合物被微生物的代谢作用分解为带有羧基、羟基、羰基的脂肪酸、有机酸和醇类等中间产物；“路径 2”表示这些中间产物被进一步降解为甲烷底物（二氧化碳、乙酸及氢气等简单化合物）；“路径 3”为甲烷底物在产甲烷菌的作用下形成甲烷。从图中可以看出中间产物种类多样，说明煤层甲烷的产生需要多种具有不同代谢功能的微生物参加，相互配合共同完成。因此，从煤到甲烷需要经过一系列的物质转化，煤层甲烷的产生需要多种相互作用的微生物参加。产甲烷菌不具有直接分解有机质的能力，它主要以发酵菌和产氢气产乙酸菌分解有机质而产生的 CO2、H2 和乙酸等作为碳源和能源，最终生成甲烷。产甲烷古菌可分为三大类，第一类产甲烷古菌包括Methanobacteriales、Methanococcales、Methanopyrales，多以 H2/CO2 为底物，某些成员可利用甲酸；第二类是 Methanomicrobiales，利用的底物类型与第一类产甲烷菌类似，有些可利用仲醇；第三类是 Methanosarcinales，具有多细胞结构，至少可以利用 9 种底物，包括 H2+CO2、一氧化碳、甲醇、醋酸、甲基胺、2,3-甲3第 1 章前言基胺以及乙基二甲基胺等。1.2 国内外煤层气研究现状自上世纪80年代提出生物成因气的概念以来13，世界上许多国家开始涉足微生物增产煤层气领域。利用地球化学方法，如同位素检测、煤层气的气体组成分析等，世界各地的生物成因煤层气被源源不断的检测出来14-16，而且生物成因煤层气还是许多煤田煤层气的主要来源17-19。由此，现存煤层中是否存在与生物成因煤层气产生相关的微生物，它们的活性如何、如何作用等问题成为研究者关注的焦点。1.2.1 国内现状近年来，随着微生物技术的发展，对煤层中生物成因煤层气微生物学的机理有了进一步认识，煤层气田产出水和煤样中微生物的分析技术也得到了极大促进和提高。我国对微生物增产煤层气的研究起步较晚，目前工作主要集中在模拟成气实验方面，在厌氧细菌的计数、分离、富集培养方面已经取得了一定的成果，但在煤地质微生物分离上还没有取得突破。其中刘洪林等人从低煤阶煤层样品中分离出来产甲烷菌，并发现其中含有的产甲烷菌在适宜的地质条件下能够分解煤层产生甲烷气体。苏现波等人研究了微生物生成甲烷的影响因素，确定了产甲烷的最适 pH 为 8，否则会导致甲烷含量的减少；相比于 pH，盐度的影响较小，但当盐度超过一定值时，甲烷的生成量也会大幅降低20。此外，林海等人对产甲烷菌群进行了驯化，发现该菌群的产气能力得到显著提高。在新技术的支持下，虽然取得了一定成果，但是在生物降解煤产甲烷方面认识仍然不足，在代谢过程中有哪些微生物参与，各微生物在代谢过程中的作用如何等问题还需要进一步探索。1.2.2 国外现状在煤层微生物的研究领域，国外已经有很多经验，相比于国内的实验室实验，对煤炭生物成气过程中微生物菌群的分离培养及其特性研究已有较多成果，已经深入到分子化学水平。Michael 等人从粉河盆地煤层气井水样中富集培养获得了本源产甲烷菌，4第 1 章前言论证了该盆地的煤层中存在活性产甲烷菌群，且它们可以利用煤作为主要基质生产甲烷；并且利用 16S rRNA 序列分析，确定了不同微生物之间的进化关系和同源性21。Singh 等人从煤层水水样中提取 DNA 后用古生菌和细菌的引物进行16Sr RNA 扩增，并鉴定出有甲烷杆菌目和甲烷微菌目的微生物存在，这些微生物以 H2 和 CO2 为基质合成甲烷。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术和 16S rRNA 焦磷酸测序在煤层水微生物的研究中也得到应用。在煤层气开采利用方面，国外也只有少数国家进入大规模工业化生产，大部分都处于基础研究阶段，煤层气开发利用进程需要进一步加快。1.3 本文研究背景及研究内容通过查阅文献了解到，目前研究者对微生物增产煤层气的探索正逐步增加，对于生物成因煤层气的定义以及生物甲烷的形成过程也有了大量研究，微生物增产煤层气技术正受到越来越多的关注。但是受到传统微生物分离培养方法的限制，分离出的微生物仅占环境样品总数的 1% 10%，不利于对煤层微生物种类的全面分析，阻碍了对煤层气形成机理的微观研究。随着分子生态学技术的发展，采用高通量测序技术可以较好地解决这一问题。高通量测序技术是一种能够进行深度测试的分子生态学技术，它的发展极大的克服了普通分子生态学技术的局限性，保证了丰度较低的物种也能正确地检测出来，对物种的分析更加准确。因此，本研究首先采用高通量测序技术对煤层中菌群的组成和丰度进行分析，明确取样点环境中存在的优势菌群的种类和数量，分析出煤层环境中对生物甲烷代谢起有利作用的细菌和古菌种类，为解析参与煤层有机质降解形成甲烷的优势菌群提供科学依据。在微生物增产煤层气的作用机理方面，虽然对煤层气的形成过程有了一定研究，但是在产物气体组分分析以及微生物对煤结构的影响方面还需进一步研究。因此，本研究内容针对微生物与煤作用前后的代谢产物及华北油田提供的煤样进行煤组分和结构分析，以明确微生物对煤层气增产的影响机制。采用气相色谱分析法对微生物作用后的代谢产物进行分析，明确微生物对煤的作用程度及煤层气的成因类型；运用红外光谱法测定微生物代谢后煤样官能团的变化；采用XRD 检测分析微生物作用后煤结构的变化情况，以及压汞法检测微生物作用前后煤样孔隙率及孔径的变化。由此总结出煤层环境中的微生物群落及其对煤的作5第 1 章前言用机理。6第 2 章煤层环境中微生物群落结构分析第 2 章煤层环境中微生物群落结构分析要深入研究煤生物成气的机理，必须对煤层微生物的种类进行全面分析。高通量测序技术是一种能够进行深度测试的分子生态学技术，它的发展极大的克服了普通分子生态学技术的局限性，保证了丰度较低的物种能正确地检测出来，大量的数据也使得对物种的分析更加准确。因此，本研究拟采用高通量测序技术对煤层中菌群的组成和丰度进行分析，为解析参与煤层有机质降解形成甲烷的优势菌群提供科学依据。2.1 实验方法2.1.1 基因组 DNA 的提取与纯化高通量测序的前提是进行 DNA 的提取与纯化。高纯度和高浓度的 DNA 样品能够减少高通量测序的误差，可以保证菌群分析结果更接近实际环境中的微生物群落结构。本研究内容针对华北油田三个时段的煤层水样品，采用 CTAB 法进行了 DNA 的提取与纯化，为菌群的丰度分析、种类分析做准备。实验仪器（a）抽滤装置（b）无菌操作台（c）琼脂糖电泳仪（d）DNA 浓度测试仪图 2-1 基因组 DNA 提取与纯化实验仪器7第 2 章煤层环境中微生物群落结构分析实验样品实验所用样品为华北油田同一口井（井 Z1-312）中三个不同时段所取的煤层水样品，且保证三个时段的井内环境相同，三个样品分别标记为“Z1-312 2 月 20日”，“Z1-312 3 月 16 日”和“Z1-312 3 月 26 日”。实验步骤1. 取样根据取样要求，在三个时段对煤层水样品进行采集，将样品分别装入无菌桶内密封，静置。2. 实验前准备主要的实验前准备工作为对实验用品进行高温灭菌处理，防止外源菌对样品中微生物产生污染。3. 抽滤（1）将煤层采出水放于 4 C 层析实验冷柜中化冻 3-4 天；（2）将全部采出水样品倒出，放于 70 C 烘箱 1 h，然后分装在 500 ml 分液漏斗中进行分液以尽可能的分离油和水；（3）在超净工作台中组装抽滤装置；（4）使用循环水真空泵将采出水经定性滤纸过滤，再将滤液依次经过不同孔径滤膜，分别把滤膜装在 50 ml 离心管中待用离心。4. 提取与纯化 DNA（1）滤膜加 5-7 ml SET 缓冲液用匀浆机打碎，离心收集菌体；（2）去掉上清液后加入一定量的缓冲液及溶菌酶，37 C、150 rpm/min 温育 1 h；（3）加入 23 l 10%SDS 和 5 l 蛋白酶 K（40 mg/ml），37 C、150 rpm/mim 摇床温育 2 h；（4）加入 56 l CTAB-NaCl 溶液，轻轻颠倒混匀后，65 C 水浴 20 min；（5）加入等体积的酚：氯仿：异丙醇=25:24:1 的混合液，离心后保留有机相，如此重复三次；（6）将上述离心管 4 C、11000 r/min 离心 20 min，去上清；加入 500 l 70%冰冷乙醇洗 DNA，4 C、11000 r/min 离心 10 min，重复一次后，尽量吸尽管中的液体，但注意不要吸到 DNA 沉淀，室温下干燥 DNA；8第 2 章煤层环境中微生物群落结构分析（7）用 20-100 l TE 缓冲液（pH=8.0）溶解 DNA；（8）测定提取的 DNA 浓度。2.1.2 菌群种类和丰度测定菌群种类分析是对样品中优势菌群的菌属类型进行统计，其目的在于明确取样点环境中存在的优势菌群的种类；菌群丰度分析是为了统计样品中微生物种类的数量，其目的在于明确取样点环境中存在的优势菌群的数量。本研究内容采用高通量测序技术对煤层水中的细菌和古菌群落结构进行测定，并进行分类统计，明确煤层水中细菌和古菌的种类和丰度，分析出煤层环境中对生物甲烷代谢起有利作用的细菌和古菌种类。实验仪器（a）高通量测序仪器（b）PCR 扩增仪图 2-2 菌群丰度和种类测试仪器实验步骤1. 16S rDNA 的 PCR 扩增和克隆文库的构建DNA 提取与纯化完成后，采用细菌 16S rDNA 扩增通用引物 1492R（5-GGTTA CCTTGTTACGACTT-3）和 27F（5-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3）进行扩增。采用通用引物 w017（6F，5-ATTCYGGTTGATCCYGSCRG-3）和古菌通用引物 w002（1509R，5-GNTACCTT GTTACGACTT-3），进行古菌 16S rDNA 的 PCR 扩增。设置适当的反应条件进行延伸。上述 PCR 产物经纯化、补平和磷酸化后，连接到 PTZ18 质粒载体的 Smal 位点上，转化大肠杆菌细胞。在含有 X-gal 和氨苄青霉素的 2YT 培养基上选择具有氨苄青霉素抗性的白色转化子，构建 16S rDNA 文库。2. RFLP 酶切分型和序列测定9第 2 章煤层环境中微生物群落结构分析对细菌文库克隆进行 PCR 检测，并选用合适的限制性内切酶进行限制性内切酶片段长度多态性分析，筛选得到不同的多态性克隆。采用边合成边测序的方法，对样品进行高通量测序，从而得到 16S rDNA 标签序列。2.2 实验结果分析2.2.1 基因组 DNA 分析1. DNA 凝胶电泳图分析DNA 琼脂糖凝胶电泳图如图 2-3 所示。M123M图 2-3 DNA 琼脂糖凝胶电泳图图 2-3 中，M 代表 Loading Marker；1 代表“Z1-312 2 月 20 日”样品；2 代表“Z1-312 3 月16 日”样品；3 代表“Z1-312 3 月 26 日”样品。图中 3 个样品均出现了 DNA 条带，都达到了进行高通量测序的标准。其中1 号样品的 DNA 条带较弱，说明 DNA 浓度较低；2、3 号样品的 DNA 条带较为强，说明 DNA 浓度较高；3 号条带出现拖带现象，可能是由酶的质量较差所导致的。2. DNA 浓度分析上述各样品的 DNA 浓度如表 2-1 所示。表 2-1样品的 DNA 浓度样品Conc(ng/l)Z1-312 2 月 20 日124.2Z1-312 3 月 16 日224.1Z1-312 3 月 26 日255.510第 2 章煤层环境中微生物群落结构分析从表 2-1 中可以看出，“Z1-312 2 月 20 日”样品的 DNA 浓度最低，“Z1-312 3 月 16 日”和“Z1-312 3 月 26 日”样品的 DNA 浓度较高，与 DNA 琼脂糖凝胶电泳图的结果一致。2.2.2 群落种类和丰度分析如图 2-4，图 2-5 所示分别为各水样中细菌和古菌在属水平上的高通量相对丰度图。图中的各种颜色代表一个菌属，每种颜色条块的高度代表该菌的相对含量，因此高通量相对丰度图能够反映微生物的种类和相对含量。图 2-4 三个样品中的细菌在属水平的高通量相对丰度11第 2 章煤层环境中微生物群落结构分析图 2-5 三个样品中的古菌在属水平的高通量相对丰度对比三个样品中的群落结构可以看出，“Z1-312 3 月 16 日”和“Z1-312 3月 26 日”样品中细菌和古菌的条块颜色较多，说明样品中细菌和古菌种类较多，微生物丰度较大，所以这两个样品微生物的群落结构较复杂。“Z1-312 2 月 20日”样品中细菌和古菌的条块颜色较少，说明样品中细菌和古菌种类较少，微生物丰度较低，所以这个样品微生物的群落结构较简单。而且 “Z1-312 3 月 16 日”和“Z1-312 3 月 26 日”样品中细菌和古菌的高通量相对丰度图颜色种类相似，但每种颜色对应条块的高度存在差异，表明水样的菌群种类相似而相对含量不同，即这两个水样的群落结构相似。与这两个样品相比，“Z1-312 2 月 20 日”样品中细菌和古菌种类要少很多，说明该水样的细菌和古菌群落结构与后两个样品的群落结构存在显著差异。对比图 2-4 和图 2-5 发现，在同一样品中，古菌的高通量相对丰度图颜色种类比细菌少，这说明在同一时段内古菌种类少于细菌种类。此外，高通量相对丰度图中高度较大的颜色条块代表微生物群落结构中含量较多的菌种，即优势菌。从图 2-4 和图 2-5 中可以看出优势细菌和古菌种类如下：1. “Z1-312 2 月 20 日”样品中的优势细菌和古菌在 “Z1-312 2 月 20 日 ” 样品中，细菌的优势菌种为硫磺单胞菌属12第 2 章煤层环境中微生物群落结构分析Sulfurospirllum （44.67%）和鼠孢菌属 Selenomonadales (19.12%)。而古菌的群落结构较为简单，且所有的古菌均为产甲烷古菌，其中的优势古菌为甲烷八叠球菌属。2. “Z1-312 3 月 16 日”样品中的优势细菌和古菌在“Z1-312 3 月 16 日”样品的细菌群落结构中，主要的优势菌有厌氧绳菌科 Anaerolineaceae_uncultured （ 15.11% ）、 Candidate_division_OD1_norank（13.57%）、生丝微菌属 Hyphomicrobium （9.43%）等。在此样品中古菌的种类较多，其中优势古菌为甲烷杆菌属（57.77%）和甲烷鬃菌属（30.41%）。3. “Z1-312 3 月 26 日”样品中优势细菌和古菌在“Z1-312 3 月 26 日”样品的细菌群落结构中，主要的优势菌有根瘤菌Rhizobium（27.49%）和鞘脂单胞菌属 Sphingopyxis （14.73%）。“Z1-312 3 月26 日”和“Z1-312 3 月 16 日”样品中的古菌群落结构相似，它们的优势菌也相似，为甲烷杆菌属（56.14%）和甲烷鬃菌属（39.93%）。微生物增产煤层气的原因主要是甲烷代谢细菌和产甲烷古菌的作用，因此统计出样品中有利于生物甲烷代谢的细菌和产甲烷古菌的种类及含量。表 2-2 “Z1-312 2 月 20 日”样品利于生物甲烷代谢的细菌和产甲烷古菌的含量分类菌属占细菌（或古菌）的比例/%占总菌数的比例/%硫磺单胞菌属44.670甲烷代谢细菌43.638固氮螺菌属1.770甲烷八叠球菌属99.210产甲烷古菌甲烷杆菌属0.6056.040甲烷食甲基菌属0.18613第 2 章煤层环境中微生物群落结构分析表 2-3 “Z1-312 3 月 16 日”样品利于生物甲烷代谢的细菌和产甲烷古菌的含量分类菌属占细菌（或古菌）的比例/%占总菌数的比例/%Synergistaceae5.140苯基杆菌属2.110甲烷代谢细菌6.925硫磺单胞菌属0.040固氮螺菌属0.080甲烷杆菌属57.771甲烷鬃菌属30.408甲烷杆菌科2.444甲烷粒菌属6.040产甲烷古菌甲烷囊菌属0.6496.012甲烷泡菌属0.091Methanoregula0.056甲烷八叠球菌属1.466甲烷螺菌属0.600表 2-4 “Z1-312 3 月 26 日”样品利于生物甲烷代谢的细菌和产甲烷古菌的含量分类菌属占细菌（或古菌）比例/%占总菌数的比例/%鞘脂单胞菌属14.730甲烷代谢细菌15.856丛毛单胞菌科2.140甲烷杆菌属56.142甲烷鬃菌属39.934甲烷杆菌科2.768甲烷粒菌属0.298产甲烷古菌6.039甲烷囊菌属0.019甲烷泡菌属0.470甲烷八叠球菌属0.298甲烷螺菌属0.06314第 2 章煤层环境中微生物群落结构分析由上述表格可知：“Z1-312 2 月 20 日”样品中有利于生物甲烷代谢的细菌主要有硫磺单胞菌属（Sulfurospirllum）和固氮螺菌属（Azospira），古菌主要为甲烷八叠球菌属；“Z1-312 3 月 16 日”样品中有利于生物甲烷代谢的细菌有Synergistaceae_uncultured 、苯基杆菌属（Phenylobacterium ）、硫磺单胞菌属（ Sulfurospirllum ）和固氮螺菌属（ Azospira ），古菌主要为甲烷杆菌属（Methanobacterium）和甲烷鬃菌属（Methanosaeta）；“Z1-312 3 月 26 日”样品中有利于生物甲烷代谢的细菌有鞘脂单胞菌属（Sphingopyxis）和丛毛单胞菌科（Comamonadaceae_unclassified），古菌主要为甲烷杆菌属（Methanobacterium）和甲烷鬃菌属（Methanosaeta）。对比图 2-4、图 2-5 的优势菌种可以看出，有利于生物甲烷代谢的细菌和产甲烷古菌大部分是样品中的优势菌种，因此样品中细菌和古菌的优势菌种对生物甲烷的生成起着重要的作用。此外，三个时段的样品中有利于生物甲烷代谢的细菌所占比例均比古菌高，说明在生物甲烷的生产过程中细菌起着重要的作用。2.3 本章小结本章内容针对华北油田煤层水样进行了 DNA 的提取与纯化、菌群种类和丰度分析等研究工作，得出结论如下：1. 三组样品微生物群落结构差异较明显， “Z1-312 3 月 16 日”和“Z1-312 3 月 26 日”样品微生物群落结构比较相近。2. 同一样品中古菌种类少于细菌。3. 样品中细菌和古菌的优势菌种对生物甲烷的生成起着重要的作用。15第 3 章 微生物增产煤层气的机理研究第 3 章 微生物增产煤层气的机理研究目前，人们对微生物利用煤作为原料生成甲烷逐渐达成共识，即只要温度、压力、pH 值、Eh 值、矿化度和营养物质满足微生物的生长要求，就可以把煤转化为以甲烷为主的气体，且煤颗粒越小微生物的代谢速度越快，产气效果越好。但目前对于微生物增产煤层气的作用机制尚不明确，因此，本研究内容针对微生物与煤作用前后的代谢产物及华北油田提供的煤样进行煤组分和结构分析，以明确微生物对煤层气增产的影响机制。3.1 增产煤层气效果分析微生物与煤作用前后代谢产物分析分为气体组分分析和气体同位素分析两部分。通过气体组分分析，能够测定微生物与煤作用产生的气体中甲烷含量和生物气种类，明确微生物对煤的作用程度；通过气体同位素分析，能够明确煤层气成因的类型，进一步了解微生物甲烷代谢的机理。3.1.1 气体组分分析色谱分析法根据物质的物理性质的不同，可以对混合物中各组分进行分离、分析，从而确定煤层气中的组分及含量。因此本部分采用气相色谱仪对华北油田微生物作用前后的煤层气样品成分进行了测定，明确生物作用煤层气的成分和含量。实验仪器图 3-1 气相色谱仪实验样品实验样品为华北油田五口井中的煤层气，分别在三个时间（2 月 20 日、 3月 16 日、3 月 26 日）进行取样，采用气相色谱法对气样进行生物气种类和含量16第 3 章微生物增产煤层气的机理研究分析。实验步骤将分析样品在进样口中气化后，由载气（氮气）带入色谱柱，通过检测混合物中的色谱柱，根据不同的保留性能使各组分分离得到检测信号。通过检测顺序得到气体组分，并且可以通过检测峰的高度和面积得到各气体组分的含量。实验结果分析1. 2 月 20 日气样结果对 2 月 20 日五个气样的分析结果如表 3-1 所示：表 3-1 2 月 20 日气样种类和百分含量分析结果组分甲烷乙烷氢气二氧化碳氮气氧气V/V%V/V%V/V%V/V%V/V%V/V%井-177.7350.0370.1075.45916.662/井-280.2860.0210.1263.86615.701/井-379.7050.0382.5488.3509.359/井-469.6700.0260.02814.95015.326/井-586.9140.0790.0260.63912.342/由表 3-1 得，样品生物气种类百分含量分析图 3-2 如下：(1) 井-1(2) 井-2(3) 井-3(4) 井-4(5) 井-5图 3-2 生物气种类含量关系图17第 3 章微生物增产煤层气的机理研究从表 3-1 及图 3-2 中可以看出，气体由甲烷、乙烷、氢气、二氧化碳和氮气组成。其中甲烷含量最大，为 69.67%86.91%，氮气含量次之，为 9.36%16.66%，二氧化碳含量第三，为 0.64%14.95%，乙烷和氢气的含量均较小，且气体中不含氧气。所以该气体主要以甲烷为主，符合煤层气的性质。但是通过对比五个气样可以发现煤层气样品中甲烷含量的跨度很大，如图 3-3 所示。图 3-3 气样中甲烷百分含量分布图从图 3-3 中可以看出，煤层气中甲烷含量存在不均匀性。2. 3 月 16 日气样结果对 3 月 16 日五个气样的分析结果如表 3-2 所示：表 3-2 3 月 16 日气样种类和百分含量分析结果组分甲烷乙烷氢气二氧化碳氮气氧气单位V/V%V/V%V/V%V/V%V