jiao1.1DNA重组技术的基本工具.ppt

基因工程,专题1,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,艾弗里证明 ，DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体。,DNA是遗传物质,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,DNA的双螺旋结构和中心法则的确立。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,1)基因转移载体的发现 2)工具酶的发现 3)DNA合成和测序技术的发明 4) DNA体外重组的实现 5)重组DNA表达实验的成功 6)第一例转基因动物问世 7)PCR技术的发明,基因工程的产物,一、基因工程的概念： 又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。,基因重组,生物体外,基因/DNA,分子水平,剪切拼接导入表达,人类需要的基因产物,回顾：,优点： 定向地改造生物的遗传性状； 实现基因在不同物种之间的转移，迅速培育出生物新品种,问题探讨：,苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因.让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。 想一想需要做哪些关键工作？,普通棉花 抗虫棉,DNA重组技术的基本工具,工欲善其事, 必先利其器.,想一想:获得转基因抗虫棉关键步骤或难点是什么? 实现这一精确的操作过程的工具是什么呢?,基因工程培育抗虫棉的关键步骤：,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,关键步骤二：,抗虫基因与棉花DNA“缝合”,关键步骤三：,抗虫基因进入棉花细胞,解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？,“分子手术刀” 限制性核酸内切酶,“分子缝合针” DNA连接酶,“分子运输车” 基因进入受体细胞的载体,1.1、DNA重组技术的基本工具,一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,1.主要来源： 2.种类与命名： 3.作用特点（特异性） 4.限制酶识别序列 5.作用结果：,识别特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,主要从原核生物中分离纯化,产生黏性末端或平末端,Go on,大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成 少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成,思考与探究 P7 （2）,为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列；或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。,种类与命名：,现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。,EcoR,Sma,粘质沙雷氏杆菌 （Serratia marcesens）,大肠杆菌 （Escherichia coli R）,Go back,练习：流感嗜血杆菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:,Hind、Hind和Hind,限制性内切酶与DNA解旋酶的区别,切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键,将DNA两条链的氢键打开形成两条单链,限制性内切酶与DNA水解酶的区别,切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键，形成片段的DNA.,切割磷酸二酯键，形成单个的脱氧核苷酸。,限制酶的识别序列：,能被限制性内切酶特异性识别的切割部位都具有回文序列：在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。,EcoR,黏性末端,黏性末端,Go back,EcoR,黏性末端,黏性末端,重复演示,什么叫黏性末端？,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,Sma,平末端 平末端,限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中轴线（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的。,想一想限制酶所识别的序列有什么特点？,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？,要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,思考?,GAATTC CTTAAG,GAATTC CTTAAG,EcoR,不同来源的DNA片段混合,将不同种来源的DNA片段连接起来,生物A基因片段,生物B基因片段,G AATTC CTTAA G,酶切,GAATTC CTTAAG,同一种,二、“分子缝合针” DNA连接酶,作用:,把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.,作用原理：,催化磷酸二酯键形成,类型：,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T4噬菌体,恢复 磷酸 二酯键,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端(效率较低),相同点,差别,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,Ecoli DNA连接酶 或T4DNA连接酶,即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低,T4DNA连接酶,寻根问底,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?,1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,形成磷酸二酯键,1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链,2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板,三、“分子运输车” 基因进入受体细胞的载体,载体需要的条件： 有1多个限制酶切点 对受体细胞无害 导入基因能在受体细胞中复制、表达 有某些标记基因，便于筛选 常用运载体： 细菌的质粒 噬菌体衍生物或某些动植物病毒,假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？,作为分子运输车载体，如果没有切割位点将会怎样？,霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？,目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？,常用的载体：质粒,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别,3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？,提示： 基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。 是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？ 不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：,思考与探究 P7,1） 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。 2） 载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。 3） 载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。 4） 载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。 5） 载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。 实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。,4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？,迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。,思考与探究 P7,1.在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（ ） 同种限制酶 B. 两种限制酶 同种连接酶 D. 两种连接酶,A,课堂练习,2.不属于质粒被选为基因