生物制药工艺学 第7章 凝胶层析.ppt

1,分子筛层析 (molecular sieve chromatography) 凝胶过滤 (Gel filtration) 排阻层析 (exclusion chromatography) 将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相，由于各组分流经体积的差异，使不同分子量的组分得以分离的层析方法。,2,洗脱曲线,3,第一节 凝胶层析原理,凝胶层析的分离过程是在装有多孔物质填料的柱中进行的。 柱的总体积为Vt，它包括填料的骨架体积Vg，填料的孔体积Vi(内水体积)以及填料颗粒之间的体积V0（外水体积）。 Vt= Vi +V0+Vg,4,5,一、原理,当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较小的分子在柱中停留时间比大分子停留的时间要长，样品各组分即按分子大小顺序而分开，最先淋出的是最大的分子。 Ve=V0+Vi Kd flash,6,二、凝胶层析的几种理论,（一）平衡排除理论 （二）扩散分离理论 （三）流动分离理论,7,（一）平衡排除理论,当溶质层流过一个填料颗粒这段距离时，溶质分子已多次进出于填料的孔，达到平衡。 平衡条件是在流速很慢时的一个极端情况。,8,（二）扩散分离理论,溶质分子在流经凝胶柱的过程中，在流动相和固定相之间没有达到平衡，存在着流速依赖性。,聚苯乙烯和苯乙烯样品淋出曲线的流速依赖性 1流速为0.65ml/min； 2流速为2.0ml/min溶剂为甲苯,9,（三）流动分离理论,红细胞在毛血细管中流动时比血浆流得快. 较大的分子较先通过或绕过这个填料颗粒，使溶质能按其大小进行分离。,10,分离过程,三种不同分子量物质的混合样品用某种规格的凝胶柱进行分离。 样品加入，以水或其他溶液进行洗脱，即得洗脱曲线 。,11,分离过程,最先流出物质A，A分子量最大，只能从颗粒间隙流过， “全排阻”。其流经体积最小，等于外水体积V0。 最后流出物质C，它分子量最小， “全渗入”。流经体积是外水体积与内水体积之和V0+Vi。 物质B分子量介于渗入限与排阻限之间。 “部分排阻”或“部分渗入”。流经体积Ve是全部外水体积加上内水体积的一部分，即Ve=V0+KdVi,12,三、分配系数Kd,排阻系数： 当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。 当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。 0Kd1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。,13,物质的Kd值,14,Kav 有效分配系数,15,过柱法测定V0及Vi,Ve=Vo+KdVi 如用全排阻（Kd=0）或全渗入（Kd=1）的物质过柱，测量其洗脱体积，计算该凝胶柱的V0值及Vi值。 蓝色葡聚糖（Kd=0） 重铬酸钾（Kd=1）,16,分配系数测定,Kd,17,思考题,已知两种蛋白在Sephadex G-100上的Kd (如血清白蛋白Kd为0.2，细胞色素C为0.7)，通过Kd 的大小我们能得到哪些信息？,18,四、凝胶层析的特点,（1）凝胶层析操作简便，所需设备简单。 （2）分离效果较好，重复性高。 （3）分离条件缓和。 （4）应用广泛（除盐，分子量测定，分离纯化）。 （5）分辨率不高，分离操作较慢。,19,20,第二节 凝胶的结构和性质,一、葡聚糖凝胶 (Sephadex) 二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex) 三、聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-Gel P） 四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ） 五、多孔玻璃微球 (Bio-glas) 六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）,21,一、葡聚糖凝胶 (Sephadex),商品名为Sephadex G类 . 交联葡聚糖的基本骨架是葡聚糖。 再经3-氯-1，2-环氧丙烷为交联剂，形成三维网状结构的高分子化合物。 其交联度是通过交联剂的加量及反应条件来控制的。,22,Sephadex G,编号间接反映： 1、吸液量； 2、溶涨时间； 3、凝胶孔径； 4、分离范围,23,葡聚糖凝胶性能与编号的关系,24,葡聚糖凝胶（G类）的规格,25,思考题,用葡聚糖凝胶分离蛋白质与多糖时，其分离范围不同，为什么？,26,葡聚糖凝胶（G类）特点,1、孔径。 2、稳定性。 3、吸附作用。 4、芳香族化合物和杂环化合物。,27,保存,保存的方法有干法、湿法和半缩法三种。 湿法：加入一定量的防腐剂置于冰箱中作短期保存（6个月以内）。 常用0.02%叠氮化钠、0.02%三氯叔丁醇、20%乙醇等。,28,二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex),（一）亲脂性葡聚糖凝胶（Lipophilic Sephadex） 骨架结构上引入一些有机基团，如甲基、羟丙基，使呈亲脂性，同时保留亲水性。 （二）交联葡聚糖离子交换剂（Sephadex ion-exchanger） 将活性交换基团连接于葡聚糖凝胶上制成的各种交换剂。,29,交联葡聚糖离子交换剂,30,（三）Supperdex系凝胶 由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成。 （四）Sephacryl系凝胶 是由烯丙烷基葡聚糖经甲叉双丙烯酰胺共价交联制成的。 理化稳定性好，为硬性凝胶，可耐高压灭菌。,31,Supperdex系凝胶,32,Sephacryl系凝胶,33,三、聚丙烯酰胺凝胶,商品名为生物凝胶-P（Bio-Gel P）。 该凝胶由丙烯酰胺组成；以亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，聚合而成。 特点： 1、孔径； 2、稳定性、强度； 3、无非特异吸附，保存方便； 4、编号反映出它的分离界限。,34,聚丙烯酰胺凝胶的性质,生物凝胶的编号反映出它的分离界限。 如Bio-Gel P-100。,35,四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ）,（一）琼脂糖凝胶 结构是由-D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖以-1，3-和-1，4-糖苷键相间连接而成的链状分子。,36,琼脂糖凝胶特点,1、没有共价键的交联。 2、孔径 琼脂糖的浓度。 3、琼脂糖凝胶的化学稳定性较差。 4、非特异性吸附力低。 5、颗粒强度差。 6、分离范围大。,37,琼脂糖凝胶分离范围,琼脂糖凝胶有3个规格：Sepharose2B、4B、6B分别表示琼脂糖浓度为2%，4%，6%。,38,几种蛋白质Kav值,39,（二）架桥琼脂糖凝胶（Sepharose CL）,架桥琼脂糖凝胶为琼脂线性分子经1，3-二溴丙醇交联的凝胶。 凝胶孔径均匀，机械强度明显加大。 对热和化学物质的稳定性大大增加,在pH314范围内稳定。,40,Sepharose CL的性质,41,（三）超胶（Utro-gel ACA）,超胶是琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶。 商品名称后面的编号为两位数，各表示混合胶中聚丙烯酰胺与琼脂糖的百分浓度。,42,（四） Superose系凝胶,是由珠状琼脂糖经两次交联制得的可用于HPLC的高速凝胶过滤介质。 有6%和12%两个规格。,43,五、多孔玻璃微球(Bio-glas),特点：1、化学稳定性高、强度大。 2、对糖类、蛋白质等物质有吸附作用。 3、编号表示其孔径, 越大，分离分子量也越大。,44,六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）,聚甲基丙烯酸酯凝胶和聚苯乙烯凝胶。 Styragel商品, 分离范围为1 60040 000 000。 生物珠（Bio-Bead S），适于分离分子量较小的物质。 分离不溶水的有机物质。,45,常用的商品化凝胶介质,46,一,47,email邮箱（网址：) 帐号：shengwuzhiyao ;密码：12345678,48,第二节 凝胶的结构和性质,一、葡聚糖凝胶 (Sephadex) 二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex) 三、聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-Gel P） 四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ） 五、多孔玻璃微球 (Bio-glas) 六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）,49,第三节 凝胶层析的实验条件和操作,一、凝胶的选择和处理 二、凝胶层析柱的设计和制备 三、凝胶层析操作 四、主要参数测算,50,一、凝胶的选择和处理,（一）凝胶的选择凝胶性质、分离目的 (1).将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离。 (2).将分子量相差不大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。,51,1类分离,选用Sephadex G-25凝胶，分离范围1 0005 000。 （1）使大分子的分配系数Kd=0； （2）小分子的Kd=1。,52,2分级分离,（1）使各种物质的Kd值尽可能相差大。 （2）不使分子量分布在凝胶分离范围的一侧。 （3）分子量大于渗入限的3倍，并小于排阻限的1/3。 如用Sephadex G-200分离血清蛋白质的效果要比Sephadex G-150为好。,53,分级分离,A 血清蛋白 7万 G 免疫球蛋白 17万 M 脂蛋白 200万,54,（二）凝胶粒度的选择,细粒凝胶柱流速低，洗脱峰窄，分辨率高，用于精制分离或分析。 粗粒凝胶柱流速高，洗脱峰平坦，分辨率低，用于粗制分离，脱盐。,55,（三）凝胶的预处理,使用前须溶涨，使干胶颗粒充分吸收溶剂，并达到平衡。 干胶以10倍以上吸液量的溶剂浸泡。 热法溶涨(水浴)。,56,二、凝胶层析柱的设计和制备,（一）层析柱的选择 层析柱长度与直径的比值称作“柱比”。 对于类分离，柱床体积一般为样品溶液体积的5倍，柱比5到10。 对于分级分离，则要求柱床体积大于样品体积25倍以上，甚至多达100倍。柱比在25至100之间。,57,凝胶柱床大小与所需凝胶量的关系,58,（二）凝胶柱的装填,凝胶柱底部支持物，有棉花、玻璃纤维、玻璃珠、垂熔玻璃等。 空柱中应留约1/5的水或溶剂. 不断搅拌下使胶粒均匀沉降，使不发生凝胶分层和胶面倾斜。,59,（三）凝胶床的检查和维护,观察有无凝胶分层、沟流和气泡等现象。 有色物质溶液过柱，观察柱床有无沟流，色带是否平整。 检查物质为蓝色葡聚糖。,60,操作压,层析柱由于进出口之间液位压力差形成的对凝胶颗粒的压力称作“操作压”。,61,层析床横截面所允许的最大压力,62,三、凝胶层析操作,（一）样品和加样 蛋白质类样品浓度:不大于4%。 加样时应尽量减少样品的稀释，及凝胶床面的搅动。,样品粘度对洗脱曲线的影响 柱：交联葡聚糖G-25，485cm； 流速180ml/h； 样品：0.1%血红蛋白+1.0%氯化钠； （1）相对粘度为0.118； （2）相对粘度为0.042； （3）相对粘度为0.010,63,方法,（1）直接将样品加到层析床表面。 （2）样品比重高。,64,（二）洗脱与收集,1、洗脱剂。 2、流速（操作压、型号、粒度）。 3、分部收集器。,65,（三）凝胶柱的再生,反冲 重新装柱,66,四、主要参数测算,V0及Vi的测算 Kd及Kav的值 分辨率R,67,（一）V0及Vi的测算,1重量法 Vt=Vo+Vi+Vg =/4d2h Vi=gWr Vo=Vt（Vi+Vg） Vg估算为1cm3/g干胶。 2过柱法 已知物质的洗脱体积 Ve=Vo+KdVi 如用全渗入（Kd=1）或全排阻（Kd=0）的物质过柱，测量其洗脱体积，计算该凝胶柱的V0值及Vi值。 常用蓝色葡聚糖（Kd=0）及重铬酸钾（Kd=1）。,68,（二）分配系数测定,分配系数 当测得某物质的Ve及Vt ，内水体积Vi及外水体积V0时，算出Kd及Kav的值。 Kd及Kav Ve被认为是一种组分对于某一个凝胶柱的特征常数。,69,（三）分辨率,凝胶层析中，两物质（A和B）和分辨率（R）定义为： 当R值1，两物质完全分开，小于1时则不能完全分离。 分离时较大柱床体积可增大Ve 。 减少（WA+WB）的方法是适当浓缩样品、选用小粒度凝胶、流速适当减慢等。,70,用凝胶柱分离A、B两物质，得如下洗脱曲线，请计算其分辨率,71,五、凝胶层析的扩展,（一）上行凝胶层析 利用流动和重力方向相反的上行层析法，即洗脱液向上流动的层析法。 反转柱 （二）增加有效床高 -提高分辨率 （1）串联层析 ：有效柱长 （2）循环层析：即在同一根或两根柱上，样品反复进行层析。,72,循环层析分级分离,图7.21 人血浆蓝蛋白的循环层析分离 柱：交联葡聚糖凝胶G-100，3.293cm；样品：5.2ml（3%）；流速：20ml/h； 洗脱液：0.1mol/L pH8.0 Tris缓冲液（含0.5mol/L NaCl）,简单的循环层析装置 选择阀用于选择待循环液或废液，样品从AD上柱，经BD洗脱，经检出的废液由EC排出， 需循环的物质由ED进入层析柱。,73,（三）薄层凝胶层析,用交联葡聚糖作为薄层层析的支撑载体，称“薄层凝胶层析”。 仅适用于分析 。 特点： 生化分析； 设备简单，操作方便，分离迅速； 分辨率高； 同一薄板可同时分析数个样品；,74,第四节 色谱峰变宽的问题,样品的洗脱曲线不是一个窄的矩形峰，而是一个较宽的高斯峰。 洗脱曲线： 样品的分子量分布， 仪器造成的峰加宽效应。,75,一、溶液通过色谱柱造成的峰加宽,Giddings提出的无规则行走模型。 溶质分子本身的运动是无规则的。 （一）分子扩散 （二）涡流扩散 （三）流动相中传质阻力 （三）固定相中传质阻力,76,（一）分子扩散,浓度梯度 (HETP)d=2Dm/V （HETP）d溶质分子纵向扩散对塔板高度的贡献 扰动因子，表示柱内填料对于溶质分子扩散的扰动作用。 Dm是溶质分子在流动相中的扩散系数；V流速。 (1)小而均匀的填料 (2)适当的溶剂 (3) 提高流速,77,（二）涡流扩散,与填料颗粒的形状，尤其是颗粒尺寸有关。 (HETP)e=2dp dp填料颗粒的直径； 是与填料及装填有关的常数。 (1)小而均匀的填料 (2)粒度一致且装得均匀,78,（三）流动相中传质阻力,流动相在柱中的流速是不均匀的。 溶质分子有流速的梯度而导致溶质分子的浓度梯度，径向扩散。 （HETP）m=d2pV/Dm (1)填料装得规整、紧密。 (2) 采用粒度小的填料； (3)降低流速； (4) 选用合适的溶剂（溶质的扩散系数较大）。,79,（四）固定相中传质阻力,在色谱柱中溶质分子的一部分F在流动相中，而另一部分（1F）在固定相中。 分子从固定相中脱离出来到流动相中去，而另一些分子则从流动相进入固定相中。 结果： （1）溶质层变宽； （2）溶质层作为一个整体以FV的速度运动。,80,色谱柱内造成的峰加宽,填充介质粒度越小,峰加宽效应越小。,81,溶液在柱外产生的峰加宽,（一）连接管路 当液体流经细管时，径向速度梯度使矩形溶液脉冲变成抛物面形，并导致浓度的径向梯度。 减小管径 （二）检测池,82,二、峰宽的表示方法,W是峰宽，它是通过曲线的两个拐点的切线和基线交点之间的距离。 拐点之间的距离等于2，称为峰的标准偏差。 是衡量峰的宽度的量。 W=4,83,分离效果分离度(resolution),分离效果用两个峰的峰尖距离以及两个峰的峰宽来表示。 分离度Rs的定义为： 选择性决定分离能力，表现在两个峰之间的距离上； 柱效决定峰的扩张程度，表现在峰宽W和标准偏差上。,84,分离能力： 填料颗粒的孔径大小 孔径分布 溶质分子量分布. 柱效： 溶质分子的扩散 填料的粒度和分布 填料颗粒的几何形状 柱子的尺寸 流速,85,第五节 凝胶层析的应用,一、脱盐和浓缩 二、分子量测定 三、分离纯化,86,一、脱盐和浓缩,脱盐用凝胶多为粒度大，高交联度的凝胶。 交联度大，凝胶颗粒强度好；凝胶粒度大，流速高。 样品体积最好小于内水体积的三分之一。,87,浓缩,采用包埋法 直接投入法,88,二、分子量测定,在凝胶的分离范围内，不同分子量的物质其洗脱体积Ve及分配系数Kd值随分子量增加而下降。 对于一个特定凝胶柱，待测定物质的洗脱体积与分子量的关系符合公式 Ve=-KlogM+C,89,分子量的测定,（1）求解法:（两个已知分子量的蛋白质过柱） Vel=CKlogM1 Ve2=CKlogM2 （2）标准曲线法:（先以3