用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量.doc

呵呵你的自己检查一下你的仪器蛋白质浓度的测定(四)考马斯亮蓝染色法目的要求学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beers law）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5L/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10100g蛋白质，微量测定法测定范围是110g蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4无干扰。强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris，乙酸，2巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。试剂与器材一、试剂考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G250，4.7%(W/V)乙醇。二、标准和待测蛋白质溶液1标准蛋白质溶液结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml，0.1mg/ml蛋白溶液。2未知蛋白质溶液。三、器材试管及试管架， 移液管（0.1ml及5ml），UV2000型分光光度计。操作方法一、标准法制定标准曲线取14支试管，分两组按下表a平行操作。绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。表a试管编号01234561mg/ml标准蛋白溶液/ml00.010.020.030.040.050.060.15mol/L NaCl/ml0.10.090.080.070.060.050.04考马斯亮蓝试剂/ml5ml摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色A595nm二、微量法制定标准曲线取12支试管，分两组按下表b平行操作。绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。表b试管编号0123451mg/ml标准蛋白溶液/ml00.010.020.030.040.050.15mol/L NaCl/ml0.10.090.080.070.060.05考马斯亮蓝试剂/ml5ml摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色A595nm三、未知样品蛋白质浓度测定测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/ml）。注意事项（1） 如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的520min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。（2） 测定中，蛋白染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。思考题：根据下列所给的条件和要求，选择一种或几种常用蛋白质定量方法测定蛋白质的浓度：（1） 样品不易溶解，但要求结果较准确。（2） 要求在半天内测定60个样品。（3） 要求很迅速地测定一系列试管（30支）中溶液的蛋白质浓度。 不要用 比色杯，用量大，重复性差。可以这样在96孔板里面做（可以做复孔）：每孔200微升Bradford试剂，加5微升蛋白溶液，用枪混匀或着在微量振荡器上面振匀。5分钟后在酶标仪上测定OD495，然后在Excel里面直接做均值，画标准曲线，OK！参考：Pierce公司的相关试剂盒。考马斯亮兰法（Bradford法）（一）实验原理1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。这是操作流程1. 完全溶解蛋白标准品，取10ml稀释至100ml ，使终浓度为0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。 但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。 2. 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20微升分别加到96孔板中，