大孔吸附树脂在中药新药研发和生产中的应用.ppt

大孔吸附树脂在中药新药研发和生产中的应用,屠鹏飞 （北京大学药学院）,目录,概述 第一章 大孔吸附树脂研究与应用进展 第二章 大孔吸附树脂的预处理方法研究 第三章 大孔吸附树脂有机残留物的检测方法研究 第四章 大孔吸附树脂对中药化学成分的吸附性能研究 第五章 大孔吸附树脂的再生方法研究,概 述,中药有效成分的不断阐明 中药现代化的要求 当前用于中药纯化的主要技术： 溶剂法： 沉淀法： 色谱法：大孔吸附树脂、离子交换树脂、 聚酰胺、葡聚糖凝胶等 超临界流体萃取法： 结晶法： 分子蒸馏： 超滤法： 膜分离：,第一章 大孔吸附树脂的研究与应用进展,一、大孔吸附树脂简介,1、大孔吸附树脂的合成与基本骨架,2、国产树脂的主要类型,骨架结构：苯乙烯、丙烯酸酯、丙烯腈、异丁烯等 交联剂：二乙烯苯等 致孔剂：甲苯、石蜡、汽油、煤油、碳醇、聚乙烯醇等 分散剂：明胶等,3、三菱化成的大孔吸附树脂,聚苯乙烯系列合成树脂： Diaion: HP20, HP21 Sepabeads: SP825, SP850 Sepabeads: SP70, SP700 修饰的聚苯乙烯系列合成树脂: Sepabeads: SP207 异丁烯系列合成树脂: Diaion: HP2MG,3、主要理化性质 大孔吸附树脂是一种具有大孔网状结构的高分子吸附剂。 性状：白色、乳白色至微黄色颗粒 粒度：2060目。 稳定性：不溶于水、酸、碱及有机溶剂，加热不溶，可在150以下使用。 含水量：4075%。,4、大孔吸附树脂的主要特点,1、对有机物的选择性良好，无机盐存在非但不干扰吸附反而有利于吸附。 2、吸附剂的物理、化学稳定性高，机械强度好，经久耐用。 3、再生容易，一般用水、稀酸、稀碱加低碳醇、酮等有机溶剂洗脱即可。 4、根据不同要求，选择不同树脂品种，可适用多种化合物。 5、一般系小球状，液体阻力较小，使用方便。 6、树脂脱色能力强，效果接近活性炭。,5、国产大孔吸附树脂的主要型号及生产企业,6、大孔吸附树脂对有机成分的分离、纯化原理,分离原理：主要为吸附作用；其次为分子筛作用。 不同极性、不同孔径的树脂对不同种类的化合物的选择性不同 对于分子量相似的化合物：极性越小，吸附能力越强，则越难洗脱下来；极性越大，吸附能力越弱，则越易洗脱下来。 对于极性相似的化合物：分子量越大，越易洗脱下来。,7、当前国产树脂存在的主要问题,(1)商品树脂的有机残留物高，预处理难度大； (2)树脂强度差，使用过程中破碎严重，使用寿命短； (3)树脂粒径分布广，分离效果差； (4)同一生产企业生产的同一型号树脂，各批之间比表面积和功能基团含量差别大，在中药成分纯化中重现性差。,二、大孔吸附树脂的预处理、再生及有机残留物的检测,1、树脂的预处理 预处理的方法：回流法、渗漉法和水蒸气蒸馏法等 预处理溶剂：乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇及稀酸、稀碱溶液,传统渗漉法： 有机溶剂浸泡12小时洗脱23倍柱体积（BV）浸泡35小时，洗脱浸泡，洗脱加25%盐酸浸泡，洗脱水洗至PH值中性加25%氢氧化钠浸泡，洗脱水洗至PH值中性。 缺点： 溶剂用量大：2030BV 树脂预处理时间长：23天 环境污染较大 ：,2、大孔吸附树脂的再生,简单再生：用不同浓度的溶剂按极性从大到小梯度洗脱，再用23 BV的稀酸和稀碱溶液浸泡洗脱，水洗至pH值中性即可使用。 强化再生：先用不同浓度的有机溶剂洗脱后，再反复用大体积稀酸、稀碱溶液交替强化洗脱后水洗至pH值中性，即可使用。,3、大孔吸附树脂有机残留物的检测,检测方法：GC、UV 限量标准：SDA规定苯乙烯骨架型大孔吸附树脂残留物检查项目暂定为：苯不得超过2ppm、甲苯、二甲苯、苯乙烯、烷烃类、二乙基苯类（二乙烯基）等不得超过20ppm。,三、大孔树脂在医药领域中的应用,食品工业：番茄红素、紫草色素、甜菊糖等 抗生素类生产：内酰胺类、大环内酯类、林可霉素类、氨基糖苷类、肽类、博莱霉素类、含氮杂环类及其它新抗生素的分离、提纯 中药新药研发：丹参总酚酸 、红花总黄色素、管花肉苁蓉总苯乙醇苷等 中药和天然药物生产：人参总皂苷、三七总皂苷、银杏叶总黄酮、喜树碱、苦参碱等,第二章 大孔吸附树脂的预处理方法研究,一、九种大孔吸附树脂有机残留物的定性分析,1、大孔吸附树脂型号：D101、D201、D301、HPD100、HPD400、HPD500、HPD600、AB-8、NKA-9 2、实验方法：树脂装柱，95%乙醇洗脱，洗脱液GC-MS分析 3、分析结果： D101：甲苯、二乙苯、萘、二乙烯苯 D201：二乙苯、萘 D301：二乙苯、萘 HPD100：甲苯、二乙苯、萘、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯 HPD400：甲苯、二乙苯、萘、二甲苯、二乙烯苯 HPD500：甲苯、二乙苯、萘、二甲苯 HPD600：甲苯、二乙苯、萘、癸烷、十一烷、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯、三甲苯、三乙苯、十七烷等 AB-8：甲苯、二乙苯、萘、癸烷、十一烷、十二烷、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯、三甲苯、三乙苯及大量烷烃 NKA-9：甲苯、二乙苯、萘、癸烷、十一烷、十二烷、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯、三甲苯、三乙苯及大量烷烃,二、树脂预处理工艺研究,1、不同有机溶剂对树脂D101的洗脱效果,2、酸碱洗脱后乙醇对树脂D101的洗脱效果比较,3、用碱洗脱和未用碱洗脱乙醇对D101树脂的洗脱效果比较,4、回流法对树脂D101的预处理效果,1：回流提取液 2、3、4、5：为树脂连续回流10小时后乙醇洗脱液的最大紫外吸收值，说明还残留有较大量的有机残留物； 6、7、8、9、10：碱洗脱液的最大紫外吸收值 11：酸洗脱液的最大紫外吸收值。 表明经长时间连续回流后，树脂中仍然残留有大量的有机残留物；但经碱液和酸液洗脱后树脂中的有机残留物可基本除去。,5、温浸渗漉法预处理大孔吸附树脂,表 正交设计因子、水平表,最佳工艺确定,溶剂和温度是显著因子，洗脱流速对洗脱效果有一定影响，乙醇浸泡时间作用不明显，因此，根据实验结果选定的最佳洗脱条件是A1B1C3D1。 实际生产中树脂的预处理方法：溶剂为乙醇、洗脱温度为60、洗脱流速为1.0ml/分钟、浸泡时间为1小时。,新型大孔吸附树脂色谱柱,树 脂 装 柱,碱洗液用 酸中和,2%NaOH 浸泡、洗脱,水洗至pH值中性,有机溶剂 浸泡、洗脱,药用树脂,气相或紫外检测,加热,药用树脂预处理工艺流程图,三、树脂有机残留物检查中 GC与UV的相关性考察,D-101,1BV 3.5BV,D-201,1BV 2BV,HPD-100,1BV 4BV,HPD400,1BV 3BV,HPD-500,1BV 3.5BV,第三章 大孔吸附树脂有机残留物的检测方法研究,一、检测方法的建立,1、气相色谱柱和溶剂的选择及色谱条件优化 色谱柱的考察：HP-1、HP-5、DB-WAX、 DB-624 进样方法的考察：分别比较了顶空进样法和溶剂法 溶剂的考察：分别考察了丙酮、氯仿、二氯甲烷,110,120,140,150,甲苯,二 乙 苯,萘,不同温度顶空进样考察色谱图,优选色谱条件,色谱柱：DB-624弹性石英毛细管柱（30m*0.32mm*1.8m）； 进样口：温度220，不分流； 程序升温：40以14/分钟升温至190保持1分钟； 载气：氮气（99.999%）,流量：2.5mL/分钟； 检测器：氢火焰离子化检测器（FID）,温度：250；氢气30mL/分钟，空气300 mL/分钟，尾吹30mL/分钟； 进样方式：溶液直接进样；进样量：1L。,混合对照品色谱图,苯,甲苯,二甲苯,苯乙烯,癸烷,二乙苯,十一烷,二乙烯苯,十二烷,萘,2、方法学考察,(1) 标准曲线与线性范围考察,苯： 1-5ppm, r=0.9979, Y=26.96X+1.94 甲苯： 2-15ppm, r=0.9990, Y=23.91X-3.43 二甲苯： 2-15ppm, r=0.9983, Y=13.82X-3.39 苯乙烯： 2-15ppm, r=0.9980, Y=30.51X-8.63 二乙苯： 2-15ppm, r=0.9965, Y=14.70X-5.28 二乙烯苯：2-15ppm, r=0.9946, Y=5.57X-1.17 萘： 2-15ppm, r=0.9931, Y=23.97X-14.19 十烷： 1.5-30ppm, r=0.9976, Y=29.24X-21.59 十一烷： 1.5-30ppm, r=0.9980, Y=27.27X-16.94 十二烷： 1.5-30ppm, r=0.9977, Y=25.55X-18.60,(2) 最低检测限考察,苯： 0.01ppm 甲苯： 0.008ppm 二甲苯：0.015ppm 苯乙烯：0.007ppm 二乙苯：0.015ppm 二乙烯苯：0.03ppm 萘： 0.01ppm 十烷： 0.01ppm 十一烷： 0.01ppm 十二烷： 0.01ppm,(2) 精密度考察,(3) 树脂样品提取方法,溶剂比例试验：分别称取0.2、0.3、0.5g HPD500树脂加5ml二氯甲烷超声提取10分钟，过滤，检测。,(4) 提取时间选择考察,称取三份树脂0.2克加5ml二氯甲烷分别超声提取5min、10min、20min后过滤，检测,(5) 稳定性试验,(6) 重现性试验,分别称取五份HPD500树脂0.2g加5ml二氯甲烷，超声提取10分钟，滤过，检测。,(7) 回收率试验,称取1克预处理的树脂NKA五份，分别加70ul500ppm甲苯和60ul500ppm萘标准溶液，加入4.9ml的二氯甲烷超声提取10min，滤过，检测，结果如下：,二、大孔吸附树脂有机残留物的检测结果,1、九种树脂预处理前有机残留物检测结果,2、九种大孔吸附树脂预处理后有机残留物检测结果,HPD500,HPD400,D101,不同型号药用树脂有机残留物检测结果,三、药品中大孔吸附树脂有机残留物的限量检测,苁蓉总苷胶囊,二氯甲烷溶剂对照,020716,020805,020818,020825,020907,乙肝清胶囊,030301,030302,030303,第四章 大孔吸附树脂对中药化学成分的吸附性能研究,概述,树脂适用的新药类型,适用的新药类别有四种： (1)中药有效成分的粗分与精制； (2)单味中药有效部位的制备； (3)中药复方有效部位的制备； (4)中药复方制剂中除去糖、氨基酸、多肽等水溶性杂质，以降低服用剂量或吸湿性。,使用大孔吸附树脂纯化中药应该注意的问题： (1)中药复方中各味药所含成分性质相似，可混煎后一起纯化； (2)中药复方中各味药所含成分性质差别较大的，应单独提取后再分别纯化； (3)单味药中含有多类有效成分、且性质差别较大的，各类成分应分别纯化。,成分类型与树脂的选择,脂溶性成分包括甾体类、二萜、三萜、黄酮、木脂素、香豆素、生物碱等应选择非极性或弱极性树脂，如D101、AB-8、HPD100等； 皂苷和生物碱苷类成分应选择弱极性或极性树脂，如D201、D301、HPD300、HPD600、AB-8、NKA-9等； 黄酮苷、蒽醌苷、木脂素苷、香豆素苷等应选择合成原料中加有甲基丙烯酸甲酯或丙烯腈的树脂，如D201、D301、HPD600、NKA-9等； 环烯醚萜苷类成分在树脂上吸附能力较差，应选择极性或弱极性树脂，如HPD600、AB-8、NKA-9等。,一、研究方法的建立 研究实例：肉苁蓉总苷的分离纯化,肉苁蓉的主要成分：苯乙醇苷类、环烯醚萜及其苷类、木脂素及其苷类、多元醇、水溶性生物碱、单糖、双糖、氨基酸等,1、树脂最大静态吸附量的考察,2、分离度与洗脱溶剂考察,3、树脂最大动态吸附量考察（8.91mg/g）,4、优选工艺参数的考察(正交试验),方差分析,方差分析的结果表明，因子A（上样浓度）和D（树脂柱径高比）影响显著，而因子B（上样浓度）和C（洗脱浓度）的影响不明显。 优选工艺为：A3B0C0D1,二、树脂对中药成分的吸附性能研究,系统研究了大孔吸附树脂对栀子总苷及其黄色素、贯叶金丝桃总黄酮、肉苁蓉总苷、白药子总生物碱、人参总皂苷、黄芪总皂苷、丹参总酚酸、红花总黄色素、大黄总蒽醌的吸附性能。 建立了利用大孔吸附树脂技术纯化