《层析分离技术导论》PPT课件.ppt

柱层析分离技术,柱层析分离的基本概念及其特点 柱层析分离的分类和基本原理 硅胶柱层析的应用,目录,柱层析分离是一种物理的分离过程，利用多组分混合物中各组分的物理化学性质的差异，使各组分以不同程度分布在两个相（固定相和流动相）中。 当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物理化学性质的差异，在固定相和流动相之间经过多次分配（吸附-解吸-再吸附-再解吸）以不同的速率移动，从而达到分离的目的。,1. 柱层析分离的基本概念:,分离效率高 应用范围广 高灵敏度的在线检测 快速分离 过程自动化操作,2. 柱层析分离的特点,1.按分离机理不同分类 吸附柱层析 分配柱层析 凝胶过滤柱层析 2. 根据流动相的物理形态不同分类 气相柱层析 液相柱层析 超临界柱层析,柱层析的分类,柱层析的分类,3. 根据操作压力不同分类 低压层析分离（ 20 g/d）,柱层析的基本原理,利用待分离物质中各组分与固定相和流动相的相互作用不同，通过多次相互作用将不同组分逐渐分离。,柱层析的基本原理,1.吸附层析 原理：混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物得到分离。 传统吸附剂：氧化铝、硅胶、活性炭、磷酸钙等。 特点：应用最早，价格较低；选择性低。 新型吸附层析技术：离子交换层析、亲和层析、疏水作用层析、金属鳌合层析等。,柱层析的基本原理,2.分配层析 原理：其固定相和流动相都是液体，其原理类似于液液萃取，利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。其中，固定相是由固定液与载体结合后形成的。 正相层析：固定相为极性，流动相为非极性； 反相层析：固定相为非极性，流动相为极性。,柱层析的基本原理,3.凝胶过滤柱层析 原理：根据物质分子大小不同而进行分离的色谱技术，又称分子筛色谱。由于大分子和小分子在通过色谱柱时，所通过得路径不同（大分子进入空隙，小分子进入孔内），流出色谱柱的时间不同，从而得到分离。其固定相为凝胶，流动相可根据实验需要选择不同的缓冲溶液。 主要用于脱盐、分级分离和分子量测定等。,图9-10 凝胶过滤层析原理,本章教学要求,基本要求：掌握色谱（层析）分离法的基本概念和分类，了解常用层析分离方法的基本原理及应用。 重点：凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、固定金属离子亲和层析。 难点：常用层析法的分类及其合理选用。,7.1 层析技术导论,一、层析分离的基本概念及其特点 二、层析分离的分类 三、层析分离的基本原理 四、层析理论 五、层析过程和仪器设备,一、层析分离的基本概念及其特点,层析分离技术早在二十世纪初就已在生产实践中使用。 1903年，俄国植物学家茨维特(Tswett)在研究植物叶子的组成时，用碳酸钙作吸附剂，用石油醚作为洗脱剂，他把干燥的碳酸钙粉末装到一根细长的玻璃管中，然后把植物叶子的石油醚萃取液倒入管中的碳酸钙上，萃取液中的色素就吸附在管内上部的碳酸钙里，再用纯净的石油醚洗脱被吸附的色素，于是在管内形成了数条相互分离的色带，当时茨维特把这种色带叫作“色谱”（Chromatographie）。 在这一方法中把玻璃管称为“色谱柱”，碳酸钙称为“固定相”，纯净的石油醚称为“流动相” 。因此，层析分离又称色谱分离（Chromatographic Resolution, CR）或色层分离，本章统一使用层析分离这一名称。,7.1 色谱技术导论 一、层析分离的基本概念及其特点,层析分离是一种物理的分离过程，利用多组分混合物中各组分的物理化学性质的差异，使各组分以不同程度分布在两个相（固定相和流动相）中。 当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物理化学性质的差异，在固定相和流动相之间经过多次分配（吸附-解吸-再吸附-再解吸）以不同的速率移动，从而达到分离的目的。,1. 层析分离的基本概念:,分离效率高 应用范围广 高灵敏度的在线检测 快速分离 过程自动化操作,2. 柱层析分离的特点,7.1 色谱技术导论 二、层析分离的分类,1.按分离机理不同分类 吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析 2.按固定相形状不同分类 柱层析、纸层析、薄层层析 3. 根据流动相的物理形态不同分类 气相层析、液相层析、超临界层析 4. 根据操作压力不同分类 低压层析分离（ 20 g/d）,7.1 色谱技术导论 三、层析分离的基本原理,原理：混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物得到分离。 传统吸附剂：氧化铝、硅胶、活性炭、磷酸钙等。 特点：应用最早，价格较低；选择性低。 新型吸附层析技术：离子交换层析、亲和层析、疏水作用层析、金属鳌合层析等。,1. 吸附层析,7.1 色谱技术导论 三、层析分离的基本原理,原理：其固定相和流动相都是液体，其原理类似于液液萃取，利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。其中，固定相是由固定液与载体结合后形成的。 正相层析：固定相为极性，流动相为非极性； 反相层析：固定相为非极性，流动相为极性。,2. 分配层析,7.1 色谱技术导论 三、层析分离的基本原理,原理：根据物质分子大小不同而进行分离的色谱技术，又称分子筛色谱。由于大分子和小分子在通过色谱柱时，所通过得路径不同（大分子进入空隙，小分子进入孔内），流出色谱柱的时间不同，从而得到分离。其固定相为凝胶，流动相可根据实验需要选择不同的缓冲溶液。 主要用于脱盐、分级分离和分子量测定等。,3. 凝胶过滤层析,图9-10 凝胶过滤层析原理,7.1 色谱技术导论 四、层析理论,1分配系数 2层析曲线 3理论塔板数 4分离度,1分配系数,在层析过程的某一时刻，如果流动相中样品的浓度为Cm，固定相中样品的浓度为Cs， 则分配系数K定义为：K=Cs/Cm。 如果在整个层析过程中，Cm与 Cs之间呈线性关系，即分配系数K为常数，那么该层析过程称为线性层析； 如果Cm与 Cs之间不存在线性关系，而是出现其他的函数关系，那么相应的层析分离过程就称为非线性层析。,1分配系数,为了更好地描述层析过程中Cm与 Cs之间的关系 在分配层析中直接用分配系数K表示 在吸附层析中衍生出分离因数 在凝胶层析中衍生出分配常数Kd,1分配系数 分配系数K,在分配层析中 ，分配系数：类似于溶剂萃取中的分配系数 K=cs/cm cs、cm分别为溶质在固定相和流动相中的浓度， K为分配系数。 在一定温度下，当溶质的浓度较低时， K为常数线性色谱； 当溶质的浓度较高时， K为溶质浓度的函数非线性色谱。 在层析过程中，分配系数较大的组分，迁移速度较慢；而分配系数较小的组分，迁移速度较快。因此，分配系数相差较大的两种物质很容易通过层析过程进行分离。,1分配系数 分离因数,在吸附层析过程中，为了更好地描述被分离物质在液相和固相中的浓度关系，常采用吸附等温曲线来表示。,a单分子层吸附； b多分子层吸附； c单分子层和多分子层混合吸附。,1分配系数 分离因数,分离因数：某一瞬间被吸附的溶质量占总量的分数（表示）： =cs/ct=cs/(cs+cm) 01： 当=0时，此种溶质不与固定相产生吸附作用，或固定相已无空余的结合位点，此时溶随流动相以同样的速度移动； 当=1时，溶质全部被吸附在固定相上，且不随流动相移动。 在柱色谱分离中，有效的分离通常要求值至少为0.8。,1分配系数 分配常数Kd,在凝胶层析中，引入一个分配常数Kd ，它表示某溶质分子可以进入凝胶颗粒内部空隙的分数。 凝胶色谱柱的总体积Vt分为三部分： Vt=V0+Vi+Vm V0凝胶颗粒之间空隙的总体积（即外水体积） ； Vi凝胶颗粒内部空隙的总体积（即内水体积） ； Vm凝胶颗粒基质本身所占体积。 某溶质分子充满层析柱的体积（即洗脱容积Ve）为： Ve=V0+ Kd Vi Kd=(Ve-V0)/Vi Ve被测分子的保留体积（见层析曲线） V0可采用一个分子量远超过凝胶排阻极限的有色分子来测定，此时的保留体积V1即为层析柱的V0 = V1； Vi可以选用一个可自由扩散的小分子（如中性盐）溶液来测定，此时的保留体积V2= V0 + Vi,1分配系数 分配常数Kd,0Kd1 当Kd=0时，意味着溶质分子完全被排阻于凝胶颗粒的微孔之外，而最先被洗脱； 当Kd=1时，意味着溶质分子完全不被排阻，可以自由进入所有凝胶颗粒的微孔中，而最后被洗脱。 在实际操作时，有时会出现Kd1的情况，表明除了凝胶的分子筛作用外，还存在着吸附作用。,2层析曲线,在柱层析中，常用层析曲线（又称色谱流出曲线即色谱图）来表示层析效果。,图9-3 层析曲线示意图,2层析曲线,（1）基线 （2）保留值 （3）相对保留值 （4）区域宽度,2层析曲线,无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线，在条件稳定时为一直线（如图9-3中的ot）。,（1）基线,2层析曲线,表示试样中各组分在层析柱内停留的时间数值。通常用时间或相应的流动相体积来表示。 1）时间表示的保留值 2）用体积表示的保留值,（2）保留值,2层析曲线,保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间（如图9-3中的OB）； 死时间（tM）：不与固定相作用的流动相的保留时间（如图9-3中OA所示）。 调整保留时间（ tR ）：指扣除了死时间的保留时间（如图9-3中的AB）， tR = tR - tM 注意：当固定相一定，在确定的实验条件下，任何物质都有一定的保留时间，它是色谱分析法的基本参数。,（2）保留值1）时间表示的保留值,2层析曲线,保留体积（VR）：指从进样到柱后出现待测组分浓度极大值时所通过的流动相体积。 VR = F0tR（ F0为层析柱出口处的流动相流量，即体积流动率，单位：ml/min。） 死体积（VM）：指层析柱内除了填充物固定相以外的空隙体积、色谱仪中管路和连接头间的空间及检测器空间的总和。 VM =F0tM 调整保留体积（VR）：指扣除了死体积后的保留体积。 VR = VR VM 。,（2）保留值2）用体积表示的保留值,2层析曲线,指组分2和组分1调整保留值之比，是一个无因次量，即： r21 = tR2 / tR1 = VR2 / VR1 注意：相对保留值只与柱温及固定相性质有关，与其他层析操作条件无关，它表示了层析柱对这两种组分的选择性。,（3）相对保留值r21,2层析曲线,用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法： 1）标准偏差：当层析曲线（色谱峰）呈高斯分布时，曲线两侧拐点之间距离的一半，即峰高0.607倍处峰宽的一半（如图9-3所示）。 2）半峰宽：峰高一半处色谱峰的宽度。如图9-3中的GH。 注意：由于半峰宽容易测量，使用方便，所以一般用它来表示区域宽度。 3）峰基宽度Wb：即通过流出曲线的拐点所作的切线在基线的截距，如图9-3中IJ所示。Wb与的关系：Wb 4。,（4）区域宽度,3理论塔板数,在二十世纪50年代，层析技术发展的初期，Martin等把层析分离过程比作分馏过程，并把分馏中的半经验理论塔板理论用于层析分析法。 反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系 理论塔板数的计算方法： N=5.54(tR/W1/2)2；N=16(tR/Wb)2 N-理论塔板数 tR-保留时间 W1/2-半峰宽 Wb-峰底宽度 理论塔板高度：H=L/N L-柱长,3理论塔板数,理论塔板高度越低，在单位长度层析柱中就有越高的塔板数，则分离效果就越好。 决定理论塔板高度的因素有： 固定相的材质、 层析柱的均匀程度、 流动相的理化性质 流动相的流速等。 由于同一层析柱对不同物质的柱效能不同，故用理论塔板数（n）和理论塔板高度（H）表示柱效能时应注明被测物质和层析条件。,4分离度,Rs=（两峰之间的距离）/（平均峰宽） Rs表示色谱峰的分离度 Rs1，两个峰被完全分开，即为最佳的分离条件。,4分离度,分离度取决于分离效率和选择性： 分离效率取决于峰宽； 选择性取决于两峰之间的距离。,7.1 色谱技术导论 五、层析过程和仪器设备,（1）装柱 （2）平衡（equilibrium) （3）上样(loading) （4）洗涤(washing) （5）洗脱(elution) （6）清洗与再生,1. 色谱过程,7.1 色谱技术导论 五、层析过程和仪器设备,调糊：50% 一次连续加入悬浮液 打开出口阀：层析剂沉降 排除空气 检查均匀度,1. 装柱,7.1 色谱技术导论 五、层析过程和仪器设备,用与样品相同的缓冲液对色谱柱进行平衡，直到电导率稳定为止。 缓冲液体系包括：缓冲液种类和浓度、pH及盐浓度。,2. 平衡（equilibrium),7.1 色谱技术导论 五、层析过程和仪器设备,样品处理： 溶解 选择合适的缓冲液种类 pH 盐浓度 调整样品浓度 过滤：除去不溶物 流速：根据样品浓度与吸附速度而定 上样量：80%交换容量,3. 上样(loading),7.1 色谱技术导论 五、层析过程和仪器设备,采用与上样缓冲液相同的缓冲液体系进行洗涤除去吸附在树脂表面的蛋白。 有时可加入适量表面活性剂（0.1-0.5%)； 洗涤体积：根据流出液蛋白浓度而定（A2800.05）,4. 洗涤(washing),7.1 色谱技术导论 五、层析过程和仪器设备,按操作方式 A.恒定洗脱 (isocrat