降钙素原检测及临床应用ppt课件

降钙素原检测及临床应用,成都中医药大学附属医院 张朝明 TelE-mail；,一、降钙素原（ Procalcitonin，PCT ） 1993年Assicot首次报道在各种细菌感染后血清降钙素 原（PCT）升高。 1998年Nylen等报道：PCT确实可以作为脓毒血症的生物 标记物，PCT的释放是炎症过程的一环节。 PCT是降钙素的前体、由116个氨基酸组成、分子量为 12.7kDa的糖蛋白。PCT由N-ProCT、未成熟降钙素和骨钙素 组成。 PCT由神经内分泌细胞（包括甲状腺、肺和胰腺组织的C 细胞）表达，经酶切分解为（未成熟）降钙素、羧基端肽和 氨基端肽。健康人血中仅含有少量的PCT。 已发现细菌感 染后PCT会明显升高。,降钙素原（ PCT）,正常情况下，是降钙素的前体。 健康人血液中浓度非常低， 0.05ng/ml。 当细菌感染时，全身各种组织多种类型细胞可生成PCT并释放入血液循环。,PCT的结构,脾,二、PCT检测方法,免疫层析法（色谱法） 化学发光法 酶联免疫荧光 散射免疫比浊法,1、免疫层析法（免疫色谱法）,层析法的原理 层析法是利用混合物中各组分的物理性质之差（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力等）而建立起来的一种分离技术。层析系统由固定相和流动性组成。 免疫层析技术 免疫层析技术以固定有检测线和控制线的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，通过毛细作用使待测物在层析条上移动。 待测物在测试线(T)处发生特异性免疫反应 游离物在质控线(C)处发生免疫反应,免疫层析-双抗夹心法原理,胶体金免疫层析技术,检测原理 以胶体金为显色媒介，利用免疫学中的抗原抗体能够特异性结合的原理，在层析过程中完成这一反应，从而达到检测的目的。,荧光免疫层析法,检测原理,上转发光免疫层析法,检测原理 上转发光技术（UPT)是免疫层析原理与光电转换原理相结合的免疫检测技术，以上转发光颗粒（UCP颗粒）作为示踪物，经过红外光激发后上转发光颗粒发射出可见光，实现能量的上转，通过对光学信号的转换，能够快速对待测物进行定量测定。 UCP颗粒： 两种不同镧系元素离子（分别作为光吸收子和发射子）掺杂入亚微米尺寸的陶瓷颗粒中，会构成一类能上转发光产生荧光的特殊材料（UCP）颗粒。,2、化学发光法,检测原理： 是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂)在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。,发光,Y,Y,Y,磁微粒,被测抗原,+,抗体,+,带丫啶酯标记物抗体,冲洗后,- 夹心法,（1） 加入H2O2 （pH10）,（2） 加入碱 （pH10）,化学发光法原理,电化学发光免疫分析示意图,电化学发光法原理,3、酶联免疫荧光,4-甲基伞形酮酰磷酸酯,4-甲基伞形酮 450nm处可测得荧光,检测原理,4、免疫比浊法,检测原理： 抗体与可溶性抗原反应，形成一定结构的免疫复合物，在PEG(聚乙二醇）的作用下，形成悬浮于反应溶液中的微粒，使样品浊度发生变化。在沉淀反应中形成的复合物微粒具有特殊的光学性质，当一定波长光线通过浊度发生变化的反应混合物时，光线被粒子颗粒折射而发生偏转，产生散射光。,双抗夹心法检测原理显著提高精准度,标记物,单克隆抗抗钙素抗体,单克隆抗降钙素抗体,calcitonin,katacalcin,BRAHMS PCTTM的双抗分别识别PCT肽链的两个部位，相比只能结合一个肽链部位的产品而言， 双位点结合相比单位点结合大大降低了假阳性率，检测结果更精准,抗钙素,降钙素,10./default.aspx?tree=_4_5_0&key=lumi2us,目前临床应用的cut off值是基于BRHAMS PCT试剂建立的,经过大量临床及动物实验数据的缜密计算并结合临床经验得到，由CLSI（美国临床实验室标准化协会）确认。 唯一得到FDA认证。 经过上市以来8千万次应用验证。 不同平台的B.R.A.H.M.S PCT结果具有一致性。 目前推荐的PCT诊断脓毒症或全身炎症反应的cut off值仅 适用于使用BRAHMS PCTTM测得的标本值。 BRAHMS PCT-Q 罗氏ELECSYS BRAHMS PCT 梅里埃VIDAS BRAHMS PCT,PCT Cut-off值均源自B.R.A.H.M.S,所有BRAHMS PCT结果具有一致性,Roche vs. Kryptor,Comparison of a new procalcitonin assay from Roche with the established method on the Brahms Kryptor. H. K. de Wolf, et al., Clin Chem (2009), 55 (5):1043-4,Roche 平台上的PCT结果与Kryptor 在全部的患者样本中保持高度的一致性和相关性,所有BRAHMS PCT结果具有一致性,VIDAS PCT检测结果与Kryptor PCT检测结果显示高度的相关性和一致性. 两种检测技术的结果可采用同样的cut-off 值。,VIDAS vs. Kryptor Long-term stability of procalcitonin in frozen samples and comparison of Kryptor and VIDAS automated immunoassays Schuetz P. et al., Clinical Biochemistry 43 (2010) 341344,所有BRAHMS PCT结果具有一致性,与BRAHMS PCT Kryptor（时间分辨免疫荧光）比较，结果一致性达到92% 与BRAHMS PCT LIA比较，诊断特异性达到92-98%，敏感性达到90-92%,PCT-Q vs. Kryptor Use of procalcitonin in Intensive Care Units: Comparison of semi quantitative PCT-Q Brahms assay with automated PCT-Kryptor assay Graldine Schuch. et al., Ann Biol Clin 2011 ; 69 (6) : 663-70,指标可靠：当前PCT Cut-off值均源自BRAHMS,An incorrect result can often be worse for the patient than no result at all! 错误的数值比没有数值更糟糕! - CLSI（美国临床实验室标准化协会）,PCT用于诊治细菌性感染的Cut-off值,Meisner M. Procalcitonin: Biochemistry and Clinical Diagnosis 1st Edition, 2010,指标可靠：所有BRAHMS PCT结果具有一致性,BRAHMS PCT家族成员均使用相同的校准物质和制备方法 BRAHMS PCT家族成员具有无可比拟的相关性与一致性,选择试剂厂家时的注意事项 BRAHMS试剂已有近20年的历史，无论是定量方法还是POCT方法都是最成熟的试剂，其他均是12年的新产品。 目前国外3000篇的论文用的都是BRAHMS试剂，其临床意义都是建立在BRAHMS试剂基础上。 唯一获美国FDA批准，是公认的标准方法。 不同的试剂其可能的抗原位点不一样，可能具有不同的临床意义，应用除BRAHMS试剂时，应注意与BRAHMS试剂做对照试验。,与,法国肿瘤专家意外发现了PCT的存在，德国B.R.A.H.M.S 公司全力支持PCT的研究,B.R.A.H.M.S PCT上市，从研究进入临床应用，并获得全球专利,被Thermofisher收购，B.R.A.H.M.S 成为赛默飞旗下的品牌,今天 B.R.A.H.M.S PCT 已经成为全球医生诊治 脓毒症/严重细菌感染的最重要标记物之一,1990年发现,1996年上市,BRAHMS 降钙素原 PCT,2009年加入TMO,自动化程度,手动,有溯源定量,有溯源半定量,目前国内PCT检测情况,非溯源定量,检测结果,半自动,全自动,BRAHMS PCT-Q,南京基蛋 广州万孚 武汉明德 北京热景 ,梅里埃 VIDAS BRAHMS PCT BRAHMS PCT-LIA,深圳新产业,罗氏 Elecsys BRAHMS PCT,三、PCT检测临床价值与应用,感染诊断现状,WHO(2008,2011)的统计数据提示： 感染是造成人类死亡最重要的因素 约占全球每年总体死亡率的25.5%(大约1500 万人）,每年全球死亡人数(单位: 百万),Anthony S. Fauci, M.D., et al. N Engl J Med 2012; 366:454-461,其中呼吸道感染则是导致患者死亡最主要的感染性疾病 每年约造成430万人死亡,感染诊断现状：临床诊断方法,临床症状和体征：缺乏特异性 辅助检查 血常规 白细胞和中性粒细胞：严重感染时，由于骨髓抑制，白细胞反而不升高，不能客观的反应感染的真实情况 胸部影像 胸片：敏感性和特异性较差，可能漏诊31%的疑似病例 胸部CT：敏感性和特异性优于胸片，但不适用于危重患者，且不便随访 微生物学检查 “金标准” ，耗时长，且到达急诊室的CAP患者中多达30%已接受了抗感染治疗，影响病原体检出率,叶枫, 吴璐璐. CROTC通讯. 2012年第四期第5页,感染诊断现状： 寻求理想的辅助诊断方法很有意义！,脓毒症/严重细菌性感染带来严峻挑战,临床挑战,临床需求,ICU中脓毒症发病率为8.68%， 死亡率高达44.7%, 及时诊断和治疗是提高脓毒症存活率的关键,不必要的抗感染治疗或不合理的治疗疗程给临床带来许多困扰，包括耐药的产生以及医疗资源的浪费,脓毒症的死亡率随着病情严重程度加重而上升，,特异性高,且反应快速的生化检测指标，以早期快速诊断和鉴别诊断严重细菌性感染,正确及时反映抗生素疗效的客观指标来指导临床抗感染治疗的合理性,可靠反映病情严重程度的指标，帮助监测病情进展以评估治疗措施的有效性,5.齐海宇等，严重脓毒症及其治疗中的相关问题，中国医刊2011;46(12):82-83,正常情况下，PCT是降钙素的前体 健康人血液中浓度非常低， 0.05ng/ml 当细菌感染时，PCT可生成并释放入血液循环,降钙素原PCT是脓毒症/严重细菌感染的生物标志物,Data on file-降钙素原(Procalcitonin, PCT)在血液科中的应用,感染情况下PCT的产生,健康人的降钙素,细菌感染时的PCT,Calcitonin,PCT,Mller B. et al., JCEM 2001,由于细菌感染，PCT的生成和释放具高度特异性,病毒感染时释放的IFN- 抑制PCT生成，因此病毒感染时PCT水平正常或仅轻微上升,1994年：在健康受试者中注射内毒素， 发现PCT的动力学特点,快速、高特异性的增长 在感染后2-6小时即可检测到其水平的增长 快速衰减 半衰期约20-24 小时 ，可以快速反映治疗效果 稳定性好 几乎不受肾功能状态的影响 样本反复冻溶稳定同样很高 不受肾上腺皮质激素治疗的影响,Dandona P, et al. J Clin Endocrinol Metab. 1994;79(6):1605-8,PCT与其他几种生物标志物血液动力学的比较,PCT的生成和代谢都明显比CRP快速，且基本不受肾功能影响，更适合临床早期诊断严重细菌感染/脓毒症 PCT的半衰期虽比白介素、肿瘤坏死因子等慢，但更适合临床实际应用,3.Meisner M. Procalcitonin: Erfahrungen mit einer neuen Megre fr bakterielle Infektionen und systemische Inflammation. Journal of Laboratory Medicine 1999;23(5):263-272,PCT 的理化特性,特异性高由严重细菌感染诱发的PCT生成和释放 注：病毒感染时产生的细胞因子会抑制PCT的产生 升高快速细菌侵入后，6-12hr达峰值 半衰期24小时左右，利于临床判断疗效 PCT升高的水平与细菌感染的程度呈正相关 PCT升高只存在于真正的细菌感染，细菌污染后不会升高 性状稳定体内几乎不受肾功能的影响，体外可长期保存,诊断 脓毒症/系统性细菌感染的早期诊断和鉴别诊断 监测 治疗效果的监测；指导抗生素使用 预后 病情严重程度判断和预后,健康 局部感染 系统性感染 严重脓毒症 感染性休克 （脓毒症）,PCT 的临床应用,PCT是目前严重细菌感染/脓毒症诊断的最佳指标,在ICU检测PCT、CRP、IL-6和乳酸来诊断 脓毒症，重症脓毒症和感染性休克的敏感性和特异性,AUC: PCT: 0.94 CRP: 0.89 IL-6: 0.78,与CRP、IL-6、乳酸相比，PCT是诊断脓毒症最可靠的实验室指标 (PCT与其他指标相比，P均0.001,4.MULLER B et al. Calcitonin precursors are reliable markers of sepsis in a medical intensive care unit. Critical Care Medicine 2000;28(4):977-983,Harbarth S. Am J Respir Crit Care Med 2001,PCT 提高临床诊断细菌感染和脓毒症的正确率,把PCT加入诊断标准后，诊断正确率从0.77提高到0.94,103例证实为A/H1N1感染患者，其中48例（46.6%）同时合并肺炎链球菌（54%）和金黄色葡萄球菌（31%）的感染。入院时发现合并细菌感染者PCT水平明显高于单纯病毒感染者，为29.5 (3.9-45.3) versus 0.5 (0.12-2) g/L (P 0.01)。以0.8 g/L作为临界值区分单纯病毒感染、还是混合感染的敏感性为91%、特异性为68%。,Intensive Care Med. 2011 Mar 3. Epub ahead of print,PCT有助于鉴别单纯病毒感染和混合感染,由于细菌感染，PCT的生成和释放具高度特异性,细菌感染高度特异 病毒感染时释放的IFN- 抑制PCT生成，因此病毒感染时PCT水平正常或仅轻微上升 系统性真菌感染也能引起升高，但比较细菌，其峰值相对较低，即使很严重的真菌感染，峰值在ng/ml以下。临床如果抗生素治疗后PCT下降不显著，或者开始明显下降，而临床仍有感染症状，要考虑真菌感染。联合真菌检测判断。,PCT、CRP在疾病不同程度(器官功能不全)时的水平,PCT与脓毒症严重程度相关性高，有利于病情监测,PCT浓度随着SOFA评分升高而明显呈上升趋势，相邻SOFA评分分级组间比较有显著差异 CRP浓度与SOFA评分之间则无明显相关性，不同SOFA评分分级之间CRP值没有明显差别,SOFA评分分级,SOFA评分分级,Meisner M et al. Comparison of procalcitonin (PCT) and C-reactive protein (CRP) plasma concentrations at different SOFA scores during the course of sepsis and MODS. Crit Care 1999, 3:4550,PCT-反映脓毒症患者预后信息,Harbarth S et al. Am J Respir Crit Care Med 2001, 164: 396-402,脓毒症,脓毒症患者PCT初始浓度 1ng/ml PCT浓度快速下降 1 ng/ml 预后较好,脓毒症患者PCT初始浓度100ng/ml 无变化或下降缓慢， 不能降至 1ng/ml以下 预后较差,14.Bouadma L. et al. Use of procalcitonin to reduce patients exposure to antibiotics in intensive care units (PRORATA trial): a multicentre randomised controlled trial.Lancet 2010;375:46374,开始抗生素治疗的指导方针,浓度0.25g/L 强烈建议不使用 抗生素,浓度0.25且 0.5g/L 不建议使用 抗生素,浓度0.5且 1g/L 建议使用 抗生素,浓度1g/L 强烈建议使用 抗生素,如果用于检测降钙素原浓度的血样在入院初期取得，那么6-12小时后再取样测一次降钙素原浓度,继续或停止抗生素治疗的指导方针,浓度0.25g/L 强烈建议停用 抗生素,从峰浓度下降80%，或浓度0.25且 0.5g/L 建议停用 抗生素,从峰浓度下降80%且浓度0.5g/L 建议继续使用 抗生素,与峰浓度相比浓度升高且浓度0.5g/L 强烈建议更换 抗生素,PCT可指导脓毒症患者抗生素的治疗,F. Stber, University Bonn, Lecture at ISICEM, Brussels 2001,PCT能及时反映抗生素是否有效,欧洲呼吸道感染抗生素处方量（/1000人/天）,呼吸道感染治疗的70%处方为抗生素，而大部分实际是病毒感染。 研究*显示，使用PCT监测后，抗生素用量减少50%，而结果相同。,PCT 帮助减少非必要的抗生素处方,* Christ-Crain M, et al. Lancet 2004, 363(9409) : 600-607,左上图是欧洲呼吸道感染的抗生素用量调查，横轴为各个国家，纵轴表示抗生素处方量，用每天每1000人中多少人使用抗生素表示,PCT-指导抗生素的合理使用,1、Christ-Crain M, et al. Lancet 2004, 363(9409) : 600-607 2、Christ-Crain M, et al. Am J Respir Crit Care Med. 2006,抗生素治疗的天数,PCT可以区分G-和G+菌感染，选择使用抗生素,G-菌感染与G+菌感染相比，PCT升高更加明显，以便有效指导经验型用药时抗菌药物的选择。 40例病人， G-菌感染血清PCT水平为（18558）ngml，显著高于G+菌感染者（3921）ngml，（P001）及非感染性患者（0302）ngml，（P001）；血清PCT水平区分G-菌与G+菌感染的曲线下面积（AUC）为0992（95置信区间为：0981，1004）；以091ngml为革兰阴性菌感染的阳性阈值，则灵敏度为925，特异性为950。 结论：血清PCT水平有可能作为区分重症监护病房患者革兰阳性菌与革兰阴性菌感染的指标。 中华医院感染学杂志2009年第15期 陈国强，曹华英，姚正国，等,PCT在脓毒症各阶段的Cut-off值,PCT浓度与全身性细菌感染的严重程度的相关性,Mei