westernblot实验技术及常见问题探讨-珍藏版.ppt

western blot技术,甘肃中医药大学 周文杰,western blot简介 western blot技术流程 western blot常见问题探讨,一 western blot简介,western blot即蛋白质印迹法(免疫印迹试验)，它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。,蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治斯塔克(george stark)。在尼尔伯奈特(neal burnette)于1981年所著的分析生物化学(analytical biochemistry)中首次被称为western blot。,1.western blot基本原理,通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测。,2.western blot 特点,高分辨率的电泳技术 特异敏感的抗原-抗体反应 1-5ng中等大小的靶蛋白,3.western blot 应用,二 western blot技术流程,蛋白样品的制备 sds-page 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色,1.蛋白样品的制备,通过水溶法或有机溶剂制备总蛋白 水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。,有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。,蛋白样品的定量 目前常用比色法测定样品蛋白的含量：lowry法（folin-酚试剂法）、bradford法 （考马斯亮蓝法）、 bca法等。但各有优缺点，大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。,2sds-page上样缓冲液：,蛋白样品的变性,dtt可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20冻存。按1:1比例与蛋白质样品混合，95100加热515min，冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25l，总蛋白量2050g。,2 sds-page,sds-page 是在蛋白质样品中加入sds和含有巯基乙醇的样品处理液，sds是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，dtt）可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。,sds-page基本原理,解聚后的侧链与sds充分结合形成带负电荷的蛋白质-sds复合物。蛋白质分子结合sds阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。,凝胶浓度与蛋白分离范围,灌制分离胶 隔绝空气,灌好后一般室温放置3040分钟,灌制积层胶 插入梳子,上样,过硫酸铵一般现配现用，如连续实验可在4度放置23天。配制30丙烯酰胺储存液要过滤。 配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止胶出现浓度不均的情况。 要根据温度调整temed的使用量。 水封的时候水要慢慢加入，太快会导致胶面不平。,sds-page胶制备注意事项,插梳子的时候要用力均匀，一次成型。 在上样前可20v恒压预电泳20分钟，可去除泳道中的杂质。,3 转膜,湿转系统,湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液。另外用这种方法转移双向电泳中常规使用的大胶比较困难。,湿转操作步骤： 1.起胶：将凝胶从玻璃板中取出，切除积层胶及溴酚蓝下部的分离胶，剩下的含有目的蛋白的分离胶浸泡于转膜缓冲液中，防止胶凝固、变形。 2.润湿：准备2张whatman 3#滤纸、1张nc膜，尺寸与凝胶大小相仿（滤纸与胶一样大，膜比胶大一些）， nc膜先放入水中3分钟，再放入转膜缓冲液中10分钟。（若用pvdf膜，应先在100%甲醇中浸泡，否则很难润湿。甲醇可反复利用。）,3.三明治的制作：按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、1层whatman 3#滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、1层whatman 3#滤纸、海绵，保证每层之间没有气泡。 组装顺序：转膜夹黑色面（负极）海绵垫滤纸胶 膜滤纸海绵垫红色面（正极） 切记：每层之间用滴管/玻棒将其中的气泡全部赶出，绝不允许气泡存在！,4.转膜：将转移夹放入转移槽，加入4 预冷的转膜缓冲液，将凝胶面与负极相连，硝酸纤维素膜与正极相连。,转膜电流和时间: 一般转膜的电流在200ma-400ma之间，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20ma转膜过夜。大片段的50kd的可以选用350ma,小片段的可以用250ma，上述电流均能很好的把大部分蛋白转过去。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。,转膜的注意事项： 胶在负极，膜靠近正极； 转膜缓冲液一定要事先预冷，最好提前一天 配好放4 冰箱； 滤纸不要大过膜，防止短路； 夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间 没有气泡存在，否则会导致转膜不完全； 注意一定要戴手套或用塑料镊子接触膜，因 为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会污 染膜；,在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时， 通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜 槽放置在冰浴中进行转膜。,半干转移系统,半干转移用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。因为电极板直接与滤纸接触，使凝胶中电场强度尽可能大以快速高效转移。与湿转相比，这种方法又快又好（15-45 分钟）。多数半干转移方法使用一种以上的缓冲系统，可以同时高效转移大小不同的蛋白。然而，半干转移系统因缓冲液较少不适于长时间转移。 半干转操作步骤与湿转基本类似，区别在于两边都是3层whatman 3#滤纸，转移电压和时间也有所不同。,半干转移系统中，滤纸和膜切成与凝胶相同大小很重要，这样电流必须通过凝胶。否则，在凝胶边缘处滤纸重叠将导致电流短路。 两种转移系统中都必须注意防止在滤纸、凝胶和膜之间的任何地方存在气泡，气泡阻碍转移并在印迹膜上产生“秃斑”（即非转移区）。小分子量的蛋白半干转效果比较好，大分子量（100kd以上）建议湿转。,最常用于western blot的转移膜主要是硝酸纤维素（nitrocellulose，nc）膜和聚偏二氟乙烯 （polyvinylidene fluoride, pvdf）膜，此外也有用尼龙膜、deae纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和nc膜的特点相似,主要用于核酸杂交。,膜的选择：,几种膜的对比,丽春红染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝 酸纤维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记a蛋 白探针的western印迹过程。,转膜后检测（此步可以省略）,转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的tbst（或pbst）中漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。 从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。,转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的sds-page胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。,印度墨汁不能和化学发光物合用，若是使用呈色反应的酶检测法时，印度墨汁的黑色会使凝胶难于拍照。这时，可改用其他检测方法或换用丽春红染色。 转膜后检测，多用丽春红染色，可见多条粉红色条带。 按照所检测蛋白分子量大小切下膜条，做好标记。,4 封闭,杂交膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点，为防止这些位点与抗体结合引起非特异的染色和背景，一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。,常用的封闭试剂有 5%的 bsa 或者脱脂奶粉，缓冲液一般选择 pbst 或者tbst。将膜从电转槽中取出，去离子水与pbst或tbst稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡1小时。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和tbst将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。,一般封闭条件为：室温或者 37缓慢摇荡12h，特殊情况也可 4过夜，根据结果情况调整封闭试剂的浓度和类型。比如有时 bsa 比脱脂奶粉更有利于降低非特异性背景，而有些抗体则在脱脂奶粉封闭的情况下才能得到清晰的背景。封闭完成后要进行洗膜，以去除膜上未结合的封闭试剂。洗涤液使用tbst 或者pbst。,把nc膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1ml/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。回收一抗溶液，用tbst漂洗膜3次，每次10min。加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。,5 一抗、二抗孵育,如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。同时短时间多次的洗膜（如 5-6次，每次 3分钟）比长时间少次数的洗膜更有效。 一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择最适当的比例，一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背景的深浅。要严格保证反应时间，洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景；还要注意一抗二抗的匹配。,辣根过氧化物酶法（hrp） 碱性磷酸酶法（ap） 化学发光显色法(hrp),6 反应显色,暗室操作！,滴加ecl工作液,显影、定影,在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐(bcip)转化为蓝色的产物；而辣根过氧化物酶可以以h2o2为底物，将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯萘酚氧化成蓝色产物。,另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在h2o2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺(luminol，氨基苯二酰一肼)并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。, hrp标记二抗用dab显色，按顺序依次将dab三种剂各取3滴于5ml蒸馏水中，避光混匀，将膜加入显色液中避光显色5-15min终止反应，对照marker记录实验结果，将nc膜晾干扫描保存； akp标记二抗用ap显色，在10mlakp缓冲液中加入66µ；lnbt溶液和33µ； lbcip溶液混匀，室温下将膜放入显色（37可加速反应）5-15min。对照marker记录实验结果，将nc膜晾干扫描保存。,底物发光法：将两种显色底物1：1等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将x光片覆盖在膜的上面（时间根据光的亮度来衡量），显影、定影。（荧光在一段时间后会越来越弱，要控制好时间） 除了酶连二抗作为指示剂，也可以使用其它指示剂，比如：荧光素异硫氰酸盐标记的二抗（可通过紫外灯产生荧光）；生物素结合的二抗等等。,通过加热和去污剂进行解吸 原理：组合使用去污剂和加热使抗体解离，适 用于任何化学发光底物系统。 酸解吸 原理：使用低ph改变抗体结构从而使结合位点 失活，从而将抗体与抗原分离，适用于任何化 学发光底物系统。,膜解吸方法（膜的重复利用）,膜的重复利用 如果蛋白样品非常宝贵，可以使用western一抗二抗去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。 两种方法都不能去除由显色检测系统产生的有色沉淀物（例如bcip、4-cn、dab和tmb）。然而，仍可以用针对不同靶蛋白的特异性抗体分析印迹膜。,在各次免疫检测之间不应使印迹膜干燥，印迹膜干燥将会使任何剩余抗体与膜永久性结合。 通过加热和去污剂进行解吸。 仪器和溶液： 解吸液：100mm 2-巯基乙醇，2%（w/v）sds，62.5 mm tris-hcl，ph6.7； 磷酸盐缓冲液（pbs）：10mm 磷酸钠，ph7.2，0.9%（w/v）nacl； 浅托盘，大小足以将膜放入其中。,操作： 1. 在通风橱中，将印迹膜放入解吸液中在50下振摇30分钟。 2. 将印迹膜放入缓冲液中振摇10分钟。用新缓冲液重复漂洗两次。 3. （可选）重复起始检测方法（忽略一抗步骤），确保已灭活抗体或已从膜上解吸抗体。 4. 将印迹膜放入缓冲液中振摇10分钟。 5. 继续下一轮检测的封闭步骤。,酸解吸： 仪器和溶液： 解吸液：25mm 甘氨酸- hcl，1%（w/v）sds；ph2， 磷酸盐缓冲液（pbs）：10mm 磷酸钠，ph7.2，0.9%（w/v）nacl。 浅托盘，大小足以将膜放入其中。 操作： 1. 将印迹膜放入解吸液中振摇30分钟。 2. 将印迹膜放入缓冲液中振摇10分钟。用新缓冲液重复漂洗。 3. 继续下一轮检测的封闭步骤。,western blot结果分析,内参即是内部参照，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。,在western blot中使用内参其实就是在过程中另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正蛋白质定量，上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个western blot显色或者发光体系是否正常。,常用的蛋白质内参有gapdh和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般要选择一个在处理因素作用的条件下蛋白含量不会发生改变的蛋白作内参。 为了让实验更加严谨有说服力都要设计对照实验，对照分为：阳性对照（最好有标准品（比如-actin，gapdh）或阳性血清）；阴性对照（测血时用相应小鼠未免疫血清（即正常血）；空白对照（不加一抗，用pbs代替）；无关对照（用无关抗体）。,成功进行 western blot 检测，设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到 western blot 的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！ 一般需要设置的对照如下： 阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率； 阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性；,二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性； 内参对照：检测标本的质量和二抗系统； 空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果。,western blot常见问题探讨,1 sds-page电泳,胶不平？ 凝胶漏液？,胶板洗刷干净 加入ap和temed的量要合适 加入试剂