动物繁殖学课件4转基因与克隆

转基因动物的研究,转基因动物 Transgenic animal,1980年Gordon首次获得了转基因小鼠；1982年Palmiter将大鼠生长激素基因导入小鼠胚胎，得到生长速度快2至4倍，个体比同类大一倍的“超级小鼠”。这一研究结果，说明通过对性细胞的操作，可以有效地将外源基因导入动物的基因组内，并能使之表达，产生相应的生理效应。 标志了人为地改变动物经济和遗传性状成为可能，开创了生命科学中新的研究领域。,生命科学中一个多层次、多侧面、四维的研究体系。,继连锁分析、体细胞遗传、DNA重组之后，遗传学中的第四代技术。,具有形成新兴产业的开发前景和潜能。,转基因动物 Transgenic animal,转基因动物是指应用生物工程技术培育的、含在基因组内稳定地整合、并能遗传的外源基因或特定DNA片段的动物 。,首例整合有不同外源基因的转基因动物 转基因兔 (Brem 1985) 转基因绵羊 (Hammer 1985) 转基因猪 (Hammer 1985) 转基因牛(Roschlau1989) 转基因山羊 (Ebert 1991) 转基因鱼 (朱作言1986) 转基因鸡 (Sang 1994),转基因小鼠已大量应用于基础研究的各个领域，而转基因大动物（家畜）则在应用研究中显示出良好的应用前景。,制备转基因动物的基本过程,（上游） 目的(外源)基因的克隆及重组 （中游） 重组(外源)基因向载体细胞的转移 ( 依据外源基因的性质、受体动物和载体细胞的类 型，常采用反转录病毒转染、干细胞转移、电击法、精子携带、显微注射等不同的技术途径。) （下游） 转基因的检测及转基因动物的培育,出于安全性考虑，反转录病毒转染法主要是作为实验手段应用于转基因动物的研究。,反转录病毒基因转染 法,反转录病毒(retrovirus,RV)是RNA病毒，含两条RNA，进入细胞后，反转录成双链DNA，通过DNA进行复制。己有几种哺乳类和禽类的反转录病毒，作为转基因载体 (复制缺陷型和复制互补型)。,将外源基因与反转录病毒的原病毒重组，与细胞或胚胎共培养，通过感染将外源基因转导到载体细胞的常染色体或性染色体上。这一过程都是由病毒编码的酶所介导的 。,优点:单拷贝基因导入且转导效率高，可达100%；整合常发生在病毒基因片段上，宿主基因不会被破坏；整合受病毒基因插入机制控制，不易发生大的突变；单一位点整合，易分析插入位点；,缺点:经嵌合体途径，实验周期长；转导基因不能超过10kb；不安全。在外源基因整合的同时，病毒基因也被整合到宿主染色体上，造成野生型病毒污染，有突变成新病毒及激活致癌原基因的可能。,胚胎干细胞转移基因转移 法,应用胚胎干细胞进行基因转导，不仅整合率较高，并能在细胞水平对外源基因的表达载体进研究筛选，结合相关技术手段，能实现定点操作，比如基因剔除(gene knockout)、基因置换(gene knockin)。,胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，简称ES细胞)是从哺乳动物早期胚胎的内细胞团中分离的一种二倍体细胞，可在体外培养并保持全能分化的潜能，如给予适当环境即可形成胚系集落。,因此，胚胎干细胞经转染并鉴定后，移植到哺乳动物正常发育的囊胚腔内，再将囊胚植入假孕动物子宫中，可产生嵌合体动物。转化的细胞在嵌合体中能分化发育成为全能的生殖细胞，经简单的杂交繁育即可得到携带外源基因的纯合转基因动物。,但获得哺乳动物胚胎干细胞的克隆株系具有相当的难度。目前，该方法仅在转基因小鼠的研究中应用较为成熟。,以精子作为基因的裁体制作转基因动物以其简单、高效、广泛适用的特点引起众多的科学家的广泛兴趣，大量实验证实，精子能够吸附外源DNA，而且大多数被吸附的外源DNA位于精子头部的赤道段和顶体后区，精子这种吸附DNA的能力不是简单的物理过程而是由精子头部蛋白所介导的。 极少数DNA能够穿入精子核区，这部分DNA在核区内有的被降解；有的以附加体形式存在于基因组之外，只有极少数能够整合到基因组上，而且这种整合不是随机发生的。 虽然精子吸附外源基因，通过体外受精或人工授精的途径制作转基因动物的阳性结果和阴性结果的报道时有发表，但是这些实验之间转基因效率差异极大，而且未能获得足够的数据对这一差异提供解释， 没有从理论上阐明精子携带外源基因入卵的机制，也没有建立一套可重复性的稳定的制作转基因动物技术路线。,精子载体法转基因,子,子,子,子,应用显微注射法制备转基因动物的技术路线,超数排卵,手术法回收受精卵,原核期受精卵,雄性原核,胚胎移植,产仔,外源基因,显微注射,受体母猪,同步发情,假孕母猪,每微升约含1000个拷贝基因,离心是显示原核有效的方法,外径1-2微米玻璃微针，向原核注入1-2微升,配种后18-24小时，输卵管回收,移植至同步化处理的受体输卵管内,外源基因显微注射法具有外源基因的长度不受限制，可直接转导不含载体的DNA片段，实验周期短，且较安全，是目前培育转基因动物最有效、成功率较高的技术途径； 影响因素：DNA浓度、缓冲液成份、基因构型、注射部位等 阳性率(以移植产下的原代活仔畜计)： 小鼠(17.3%)、家兔(12.8%)、大鼠(17.6%)、 牛(3.6%)、猪(9.2%)、绵羊(8.3%)。,人类疾病动物模型,特有性状的经济动物,动物生物反应器,异种器官移植,转基因动物 Transgenic animal,己培育了许多种(如白血病、高血压、肿瘤、老年病等)转基因小鼠，使人类对致病基因的发病机理、遗传规律及基因表达与结构、环境因素的关系有了一个深入的了解，从而能进行科学的诊治。,动物模型(转基因鼠),由于小鼠与人类基因具有很高的同源性，且遗传背景清晰，因此含有人类致病基因的转基因小鼠所表现的症状，与人类相应疾病具有很高程度的可比性和真实性。,同时，转基因小鼠通过对外源基因的操作，能从分子、蛋白、细胞、生理、遗传等不同水平，直接研究外源基因在个体内的动态表现，能精确地检测到一个遗传改变所发生的效应,四维的研究体系。,转基因经济动物,已获得整合有生长激素（GH）、生长激素释放因子（GRF）、肌肉生长刺激因子（cSK1）及能提高羊毛质量、牛奶产量等外源基因的转基因家畜。其中含有GH的转基因猪己稳定地的遗传了五个世代，其血液中GH均保持较高浓度，虽个体不比同胞更大，但体重增长较快，料肉转化率提高17%，背膘厚度从18.51.8毫米下降到7.01.8毫米；,因此，在转基因育种方面尚有待新技术、新理论的突破。,但由于动物的经济性状(如生长速度、瘦肉率、产蛋量等)一般是由多个基因协调控制的，仅转移单个基因较难达到理想的效果。如整合有生长激素基因的猪和羊，其血液中的生长激素水平显著提高，在表现出生长快、饲料省、瘦肉率高的同时，也存在体质普遍下降及有繁殖障碍等不良性状，难以推广应用。转基因鱼是个例外。,前期转基因动物的研究，己证实了人类基因不仅能在动物体内获得表达和遗传、并能获得组织特异性（如乳腺、血液、膀胱）和发育特异性（如泌乳期）的表达。 其中以乳腺生物反应器的进展最引人注目。,动物乳腺是一个封闭系统，外源基因局限在乳腺表达，可避免外源蛋白对动物健康的危害。 产量高，一头牛可年产乳蛋白250-300千克，绵羊和山羊也可产25-30千克。 活性好，乳腺组织可以对人体蛋白质进行正确修饰和后加工，产品的生物活性接近天然产品。 可遗传，一旦获得一个生产某种有价值蛋白质的动物个体，通过常规繁育可扩大群体。 成本低，虽前期投资大，但生产群体维持生产费用却很少。,转入人医用蛋白基因,产出含医用蛋白的牛奶,生物反应器,通过生物个体代替部份物理装置，以生物反应代替部份化学反应，来生产价值极高的蛋白质和多肽物质己为可能。人们将外源基因的信息转变成蛋白质的生物体(通常分为植物、动物两大类)称为生物反应器。,Target protein expression vector,Transgenic milk production herd,Transgenic milk,Test offspring for transgene,乳腺生物 反应器成功的 基础和关键,目前，国际上己有多种转基因动物（绵羊、山羊、猪和牛）能生产上百种医用蛋白，其中有30余种进入、期临床，有的也己进行商业开发，产生了良好的经济效益，正逐步发展成一新兴产业。,全球排名前50位的医药企业，有75%投入转基因动物的研发。,如荷兰金发马公司培育的转基因牛，生产人乳铁蛋白，提炼的营养奶粉销售额为50亿美元；英国罗斯林研究所培育的抗胰蛋白酶转基因羊，每升羊奶价值6000美元；芬兰得到红细胞生成素的转基因牛，年产奶价值为40多亿美元。,据美国红十字会和遗传学会预测，到2010_2015年，所有基因工程药物中，利用乳腺生物反应器生产的份额将占95%，约300亿美元。,器官移植已成为治疗多种器官衰竭的有效手段，因人类同种移植器官的日益缺乏，人们希望能实现异种器官的移植。猪在解剖、生理等方面与人具有较大的相似性，且易繁殖饲养被选为人类移植用异种器官的主要供体动物。,异种移植目前最大的障碍，便是受体对异种器官的超急性排斥反应，克服这一障碍便成为异种器官移植成功的一个关键。,但猪血管内皮细胞具有糖类表面抗原Galal-3Galal-4GlcNAc-R（aGAL），器官移植后，被人血清中预存的天然抗体（Xenorective natural aneibodies，XNA）所识别，触发补体分子的活化，形成攻膜复合体（MAC），发生细胞裂解作用，导致猪器官在十几分钟到几小时内就被排斥，即发生超急性排斥（Hyperacute rejection，HAR）。,异种器官移植,应用转基因技术，培育表达人补体调控蛋白，如人膜辅助因子蛋白（human membrane cofactor protein MCP）、人衰变加速因子（human decay-accelerating factor DAF）的转基因猪，有望抑制或减弱人补体对猪器官的攻击。,图为2001年12月底出生的5只可爱的转基因克隆小猪。据培育者英国PPL医疗公司称，这些转基因小猪将为研究和“生产”适用于人体移植手术使用的动物器官提供巨大的帮助。,表达混乱：1.不在预期的组织内表达； 2.子代表达情况不同；3.同一启动子在不同个体或不同动物中表达行为不同；4.整合不表达。,外源基因整合的假说： 注入的线性DNA分子游离未端所诱导的修复酶 可能引起染色体的随机断裂，DNA未端与染色体断裂处之间相互作用使外源基因整合进基因组。,整合特征：非定点的随机整合 (DNA浓度、基因构型), 染色体断裂的概率决定了外源基因的整合率。, 染色体的断裂处就是外源的整合位点。,特点：首尾串联、单一位点的多拷贝整合。 引起插入、缺失、重复、易位等 突变,插入突变: a.致死 显性.隐性; b.非致死 表型畸变或不育,因外源基因的表达，受多种因素调节，如基因结构与整合位点，与转录有关的顺式结构和反式调节因子，外源基因在宿主体内的甲基化程度及环境因素等，这些众多的因素虽难以完全控制，但在外源基因构建时，应考虑与表达相关的调控元件。,提高整合率、实现定点整合就成为转基因动物研究的关键环节。,外源基因构建及转导的研究动向,1.导入较完整的基因而不是cDNA，是获得高效表达的有效途径,2.考虑与表达相关的调控元件,启动子(Promotor) 启动子是一DNA段，其典型结构应包括mRNA帽子位点，该位点是mRNA转录体实际开始的地方。指导目的基因进行转录的启动子类型是决定外源基因在体内能否稳定表达及表达率高低的关键因素。 在转基因动物研究中一般采用二类启动子。 多种组织细胞中表达：如MT(金属硫蛋白) 启动子 专一组织细胞中表达：如BLG(羊-乳球蛋白)启动子,内含子(Intron) 在原核生物中表达，内含子的存在似乎并无意义，这是因为原核生物缺乏基因拼接等功能。但在转基因动物中，内含子的存在却可以增加基因的表达。如大鼠生长激素基因的第一内含子对其表达是必需的。 目前在许多内含子中均发现了基因表达的增强元件。并已证实内含子能通过对转录、剪切的调控，及与增强子的协同作用影响基因的表达。,增强子(Enhaner) 宿主细胞中的调节信号并非只是位于外源基因端的启动子。位于较远距离的增强子也能对基因表达起增强作用。许多研究己表明，在任何一个分化类型的细胞中，表达的基因都可能有许多增强子参予；而基因在多个部位表达时，每个表达部位都有自己的增强子。,转基因的“援救” 将不同基因或不同构建同时注射到同一受精卵中而建立的转基因动物。不同的基因构建以首尾相连的形式整合，在某种程度上形成一个相对独立的区域，或形成一个开放的染色体活性区域。如以生长激素基因与肠道脂肪酸结合蛋白基因共注射，转基因表达提高60%。,转基因的体内重组： 将大片段DNA克隆成具有部分重复序列的较小的DNA片段，而后共注射，通过染色体外同源重组，得到大基因组DNA。如将人血清白蛋白克隆成三个片段，进行共注射， 74%的小鼠整合有完整的转基因，并表达。,酵母人工染色体(yeast artificial chromosome YAC) 是近年新发展的新型载体。能克隆大片段的外源基因。在转基因过程中能保证基因完整性，保证所有顺式因子的完整与结构基因的位置关系不变。因基因的完整性，其上下游的侧翼序列可以消除或减弱“位置效应”，提高表达。,核基质附着区(nuclear matrix attachment region,MAR) MAR是具有一定的结构和功能的基因元件(鸡溶菌酶“A”元件)。MAR能激活转录并与核基质分子有较高的亲和力，它以一个特定的模式将外源基因以颈环的方式与周围结构区隔绝开，形成独特的位置，独立的表达方式。现认为MAR的进一步研究，将为外源基因的应位整合和表达带来突破性进展。,克隆动物概述,在实践上证明了利用体细胞进行动物克隆的技术的可行性。为大规模复制动物优良品种和生产转基因动物提供了有效方法。,1997 年2 月,英国罗斯林研究所宣布, 用6岁成年羊的高度分化的乳腺细胞进行了核移植,成功地获得了克隆羊“多莉”。,这是生物技术史上具有划时代意义的重大突破,是克隆技术的一个里程碑。,在理论上证明了，同植物细胞一样，高度分化的成年动物的体细胞可在适当条件下恢复发育成个体的全能性；,“克隆”是“clone”的音译,其含义则是无性繁殖。动物克隆,就是指通过无性繁殖由一个细胞产生一个和亲代遗传性状一致、形态非常相像的动物。,主 要 内 容,一 克隆动物的生理基础 二 体细胞克隆的方法 三 体细胞克隆的历史与现状 四 克隆技术的应用 五 克隆技术存在的问题,一 克隆动物的生理基础,动物克隆的生理基础, 动物克隆所依赖的理论基础是细胞潜在全能性学说。即细胞包含个体的全部遗传信息，并在特定环境 因素的调节下，可回到与受精卵一样的状态，从头开始发育成一个完整的生物个体。 在细胞分化过程中，细胞核全能性的潜能受到阻遏。体细胞克隆的成功，说明卵子或卵母细胞能够逆转这种阻遏过程，解除细胞核的阻遏状态，使其恢复多能性，甚至全能性。 现证明，高等动物的大部分细胞核完整的保存着源于卵子和精子细胞核的全套遗传信息。,二 体细胞克隆的方法,目前，生产哺乳动物克隆的方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种。 所谓细胞核移植，是指将不同发育时期的胚胎或成体动物的细胞核，经显微手术或细胞融合方法移植到去核卵母细胞中，重新组成胚胎并使之发育成熟的过程。,直接切割,透明带内切割,分离 卵裂球,体外培养,移植,一卵多生,1、从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，此细胞称之为供体细胞； 2、从一头黑面母绵羊的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞 3、利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞； 4、将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小多莉。,体细胞克隆的技术路线,供体细胞,卵母细胞培养,重构胚胎,细胞培养,成熟卵母细胞,电融合,化学激活,胚胎体外培养,胚胎移植,核移植,去 核,去核M期卵母细胞,用甘露醇融合液电融合,用山梨醇融合液电融合,离子霉素放线菌 酮激活处理,钙离子载体放线 菌酮激活处理,一胞期重构胚胎,成纤维细胞 卵丘细胞、 乳腺细胞,屠宰场获 取卵巢,调整细胞 周期,克隆后代,三 体细胞克隆的历史与现状,1997年2月，苏格兰科学家用从一只6岁母羊的乳房上取下的组织克隆了绵羊“多莉”。这是人类历史上首次成功地克隆哺乳动物。 1997年7月，使用在实验室内培养产生并植入了一个人类基因的绵羊体细胞，苏格兰科学家克隆了绵羊“波莉”。 1998年7月，美国夏威夷大学的研究人员用一只实验鼠的细胞克隆了3代共50只实验鼠。 1999年4月，美国马萨诸塞州塔夫茨大学的遗传学家克隆了3头山羊，改变了它们的基因性状，使它们的乳液内含有一种对心脏病具有疗效的蛋白质。 2000年，美国科学家用无性繁殖技术成功地克隆出一只猴子“泰特拉”，这意味着克隆人本身已没有技术障碍。,1998 年5 月,美国科学家的研究组利用牛胎儿成纤维细胞克隆出了3 头牛,而且携带了转移的基因。 1998 年7 月,日本科学家用牛的输卵管细胞克隆出了8 头小牛。 1998年7月，美国夏威夷大学由小鼠卵丘细胞克隆了27只成活小鼠。 此后,同种体细胞克隆出的山羊、猪、马、猴、猫、兔和犬也都相继诞生。 1999 年和2002年,我国体细胞克隆山羊和克隆牛也都获得成功。,已有下列类型的供体细胞用于牛核移植,四 克隆技术的应用,克隆技术与遗传育种 (培育优良畜种),克隆技术能够快速复制出优良的动物品种。 例如：一头高产奶牛，正常情况下一生所能生产的母牛头数是很有限的，而且后代不纯不能保证是高产母牛。一般说来，要培育出一个纯度达98%的品系，需要进行20代的兄妹间交配。在牛，这就意味着需要100年的时间。而且，长时间的近亲交配会导致动物生育能力的明显降低。利用优良动物品种的体细胞作核供体克隆动物，就可以避免在自然条件下选种受动物育种周期和生育效率的限制，从而大大缩短育种年限，提高育种效率。,克隆技术与医药生产 (转基因动物生物反应器),哺乳动物的克隆技术可应用于医药领域。相当长的时间内产生转基因动物的方法主要是1985年Hammer等建立的原核显微注射法，这种方法只能使大约5%的动物携带外源基因，导致外源基因在许多转基因动物系中的表达量不高，而且因整合进生殖细胞的机率低而难以遗传给下一代，利用体细胞克隆技术，可望降低成本，实现转基因阳性动物的规模化生产。,克隆技术与组织工程 (胚胎干细胞),组织工程是应用工程学和生命科学的原理和方法，创建组织和器官或替代物，植入体内、修复组织缺损，替代损伤的组织器官，以达到提高生活生存质量延长生命的目的。在组织工程中，应用体细胞克隆技术，可以为某病人订做特定的组织器官。 目前这一领域的研究与开发正处于起步阶段，发达国家已开始研究利用克隆技术培育人胚胎，希望大批量生产治疗疾病的干细胞。 体细胞克隆组织工程具有极其重要的理论意义及巨