生化工艺实训PPT土壤中分离筛选出产淀粉酶的芽孢杆菌方法.ppt

生化工艺实训,第五组,实训项目名称： 产淀粉酶芽孢杆菌分离筛选及发酵,一、实训目的 1、掌握培养基的配制方法和菌种的分离技术。 2、掌握各级种子制备技术。 3、了解培养基和空气系统的灭菌原理，掌握灭菌技术。 4、熟悉和掌握接种操作。 5、了解小型发酵罐的基本结构，掌握发酵罐的使用方法。 6、熟悉和掌握常用的比色分析技术。 7、了解细菌培养过程的代谢变化。,二 实训内容： 1.产淀粉酶芽孢杆菌的初筛 2.产淀粉酶芽孢杆菌的复筛 3.目的菌株的保藏 4.产淀粉酶芽孢杆菌的发酵及控制 （1）种子的扩大培养 （2）培养基的制备 （3）发酵系统的灭菌 （4）接种 （5）发酵条件的控制,一.产淀粉酶芽孢杆菌初筛,1.实验材料 a. 样品 乐购超市后草坪中土壤5g b.仪器 试管、移液管、锥形瓶、涂布器 、平皿、超净台、水浴锅、玻璃棒、玻璃球等 c.培养基 :牛肉膏2.5g 蛋白胨5g 氯化钠2.5g 可溶性淀粉1g 蒸馏水500ml 琼脂2% ph7.2,2.初筛方案,5g土壤,45ml无菌水,玻璃珠,10-1土壤菌悬液,摇床震荡10分钟,85水浴15分钟,10-2 10-3 10-4 10-5,0.1ml,涂布培养,涂布完放入恒温箱中培养，待长好后加碘液，选出12株透明圈大的菌种，具体测量其透明圈和菌落直径。,3.初筛结果,表一 初筛结果（1）,分区划线培养,把上面选出的12株菌种，进行分区划线培养,取不同形态生长旺盛的菌落,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,分区划线培养,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,分区划线培养的结果,点接培养 取上述划线培养的结果，一份用于菌种保藏，一份用于点接培养。 点接方法如下所示:,1,7,3,2,4,5,6,8,9,10,11,12,点接培养,1,5,2,4,3,2,4,1,9,6,7,8,8,5,9,10,10,11,11,12,12,3,6,7,点接完放入恒温培养箱培养，待长好后加碘液，具体测其菌落及透明圈直径。,点接培养的结果,表二 初筛结果（2）,革兰氏染色,主要步骤：涂片 干燥 固定 初染(结晶紫染色1-2min) 水洗 媒染 (卢戈氏碘液媒染1min) 95%乙醇脱色(30s) 水洗 复染(番红复染约1min) 水洗 干燥 镜检,表三 革兰氏染色结果,芽孢染色,主要步骤：涂片 干燥 固定 染色(3-5滴5%孔雀绿染液，放在酒精灯上方微微加热至沸腾，开始计时5min，加热过程中勿使染料干涸，必要时要随时补充少许染料) 水洗 复染(复染2min) 水洗 干燥 镜检,表四 芽孢染色结果,二.产淀粉酶芽孢杆菌的复筛,实验材料 a样品 初筛所得4株菌种 b 仪器 分光光度计、离心机、带有过滤膜的过滤器、移液枪、注射器、牛津杯、枪头、针头、平皿等 c 淀粉检测培养基：淀粉0.4g 蒸馏水200ml 琼脂2% ph7.2 d试剂 dns试剂 葡萄糖标准溶液 1%淀粉溶液,dns法测定淀粉酶活力,一原理 在naoh和丙三醇存在下3,5-二硝基水杨酸（dns）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的naoh碱性溶液中此化合物呈橘红色，在540nm波长处有最大吸光值，在一定浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。,oh,no2,no2,cooh,+,还原糖,oh,nh2,no2,cooh,(dns),(3-氨基-5-硝基水杨酸）,二、制作葡萄糖标准曲线，取6只试管，按下表加入2.0mg/ml葡萄糖溶液和蒸馏水,在上述试管中分别加入dns试剂2.0ml于沸水中加热2min进行显色，取出后用水迅速冷却，各加入蒸馏水9ml，摇匀。,在540nm波长处测定的吸光值，以0号试管作为空白试验，以葡萄含量作为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线，如下所示：,三、酶活测定,发酵液离心处理：8000r,5min 取1ml上清液+5ml1%淀粉溶液于37度水浴5min沸水浴5min（使酶失活） 去上述处理液1ml+dns试剂2ml沸水浴，取出后迅速冷却+9ml蒸馏水，摇匀 540nm波长处测其吸光值 上清液+1%淀粉溶液直接加热煮沸+dns试剂（空白）,表五 dns法测定发酵液酶活结果,公式：样品葡萄糖含量x6x1031805,淀粉酶的酶活单位（u）：在37下，每分钟生成1umol葡萄糖所用的酶量为一个酶活单位【1umol/min】,二、平板扩散法,发酵液 离心 过滤（除菌体） 1.牛津杯法：把灭好菌的牛津杯放到提前倒好培养基并已凝 固的平皿中，每个平皿中放4个，用移液枪取过滤好的上清 液100ul 到 牛津杯中（培养基厚度、移液量、枪头大小要 一致 ），一个菌种用一个平皿，4个菌种操作完毕后，放 点样 到37度培养箱中【水解】（不能倒置培养） 2. 打孔法:先用枪头去提前倒好培养基并已凝 固的平皿中打孔 （使用枪头大小、培养基厚度要一致），用移液枪取过滤好的 上清液100ul到所打的孔中（移液量要一致），1个菌种用1 个平皿，4个菌种操作完毕后，放到37度培养箱中【水解】 （不能 倒置培养）,牛津杯法加碘液后结果,表六 平板扩散复筛结果,综合分析:,根据初筛和复筛结果可知，12号菌产淀粉酶活力高 。 初筛结果：1.d/d=3 2.d/d=1.55 复筛结果： dns法酶活=0.4116u/ml 牛津杯法 -/8 12/11 所以选择12号为最好菌种，复筛结束。,三.菌种的保藏,1.试管斜面保藏： a接种：去两支无菌试管倒入培养基做斜面，用接种环将保存在4度冰箱中的12号菌种以无菌操作的方式在斜面上划线。 b培养：37度恒温培养箱中培养16-24，贴上附有菌种详细信息的标签 c保藏：斜面长好后，直接放入4度冰箱中保藏（密封）,斜面保藏菌种,.甘油管冷冻保藏,a甘油灭菌：将1ml甘油和1ml蒸馏水加入甘管中，混匀放到灭菌锅中灭菌。 b. 接种培养：用移液管移取2ml液体培养的菌液于甘油管中，震荡使菌液充分混匀，贴上标签。 c.将甘油管置于-20度冰箱中进行保藏。 d.此方法所用甘油浓度为25%。,甘油管保藏菌种,四.产淀粉酶芽孢杆菌的发酵及控制,1.种子的扩大培养,10%接种量,液液接种,4,5,6,固液接种,100ml培养基,10%接种量,液液接种,液液接种,10%接种量,（8瓶）,（8瓶）,（9瓶）,100ml培养基,100ml培养基,100ml培养基,50l,5%接种量,2.5l,2.空气过滤器除菌,a.在空消前，必须先对空气过滤器进行消毒。 b.消毒前，先打开过滤器底部的排污阀，排尽冷凝水 c.消毒温度121度，压力0.11-0.12mpa之间，时间25-30min。 d.待蒸汽杀菌还有5min左右结束时，打开空气压缩机为下一步吹干做准备。 e.吹干，吹干时间25-30min 注意空气流量计不能通入蒸汽,3培养基的配制及灭菌,培养基配方：牛肉膏250g 蛋白胨500g 氯化钠250g 可溶性淀粉100g 蒸馏水50l ph7.2,实消:a.投料结束后，启动电机，慢速搅拌。 b.微开夹套排污阀，打开夹套蒸汽阀，保持夹套压力为0.1mpa左右，待培 养基预热达到95度以上时停止搅拌，关闭夹套蒸汽阀，开大夹套排污阀。 c.培养基温度达到95度后，缓慢打开进气阀及底阀处的蒸汽阀，同时向罐内 进气，待罐压升至0.11mpa后，打开罐面排气阀进行排气。 d.调节罐面排气阀，保持罐压0.11mpa，维持温度咋121-123度之间，计时 实消20min。 e.实消完毕，关闭底阀处的蒸汽阀。 f.在关闭进气阀处的蒸汽阀的同时打开nb型过滤器的出气阀，进行换气保持罐压在0.05-0.08mpa之间。 g.关闭夹套排污阀后，迅速打开夹套手动进水阀进行降温，当培养基温度降到90度左右时，开搅拌低速控制。 h.当培养基温度比发酵罐所需温度高1-2度，关闭夹套手动进水阀，等待接种,倒培养基,4.接种,火焰圈法接种： a.准备好合格的摇床菌种，接种量5% b.用75%酒精棉球擦洗进料口四周，放上接种火焰圈，并在接种火焰圈内围上酒精棉球。 c.减少进气量，控制罐压在0.02mpa左右后，点燃接种火焰圈内的酒精棉球 d.拧下进料口螺盖，放入盛有酒精的烧杯中 e.将接种瓶的瓶口在火焰上烧一下，并在火焰的保护下拔下瓶塞，迅速将菌种倒入发酵罐内。 f.旋上进料口螺盖后灭火焰，拧紧螺盖，并用酒精棉球擦洗干净。 g.重新调整进风量，保持罐压在0.05-0.08mpa。 接种速度要迅速，罐压不能为0，否则会导致染菌。,接种,发酵过程控制,产淀粉酶芽孢杆菌生长量的测定 接种后5分钟取第一次样，以后每隔半小时取一次样，用分光光度计 测产淀粉酶芽孢杆菌的生长量,取样,表七 菌体浓度的测定,菌体浓度生长曲线,酶活测定,发酵液酶活测定 待菌种发酵2.5小时，取第一次样用dns法测发酵液酶活，发酵4.5小时，取第二次样，用同样方法测发酵液酶活。,二、制作葡萄糖标准曲线，取6只试管，按下表加入2.0mg/ml葡萄糖溶液和蒸馏水,在上述试管中分别加入dns试剂2.0ml于沸水中加热2min进行显色，取出后用水迅速冷却，各加入蒸馏水9ml，摇匀。,在540nm波长处测定的吸光值，以0号试管作为空白试验，以葡萄含量作为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线，如下所示：,发酵液酶活测定,发酵液离心处理：8000r,5min 取1ml上清液+5ml1%淀粉溶液于37度水浴5min沸水浴5min（使酶失活） 去上述处理液1ml+dns试剂2ml沸水浴，取出后迅速冷却+9ml蒸馏水，摇匀 600nm波长处测其吸光值 上清液+1%淀粉溶液直接加热煮沸+dns试剂（空白）,dns法测发酵液酶活结果,淀粉酶的酶活单位（u）：在37下，每分钟生成1umol葡萄糖所用的酶量为一个酶活单位【1umol/min】,公式：样品葡萄糖含量x6x1031805,出料,发酵到一定阶段，要及时结束发酵。 打开底阀和放料阀，使发酵液通过放料管放出。 结束发酵,实训感想,我最想说：只学习是不行的，实践能力很重要。实训两周手机流量和