课件：混合斑检验用.ppt

,第十七章 混合斑检验,教 学 要 求,掌握 确证精液及阴道分泌液混合斑的方法及个人识别的原则与方法，包括ABO血型、血清型、酶型及DNA多态性测定。多个个体血液混合斑鉴定方法，包括ABO血型测定、DNA多态性检验。 熟悉 混合斑的概念、混合斑的种类及混合斑检验的意义。 了解 混合斑的血清型与酶型测定,笫一节 混合斑的特点和检验目的,一、概念 法医物证学的混合斑(mixed stain或mixture) 指两名或两名以上个体的体液、分泌液混合形成的斑痕。,二、分类 （一）由不同个体的同一种体液、分泌液混合而成，最常见为混合血斑； （二）由不同个体的不同体液、分泌液混合而成，最常见为精液与阴道分泌液组成的混合斑。,三、可能有混合斑的检材,（一）性犯罪案件检材，包括阴道拭子、内裤、卫生纸、床单、外生殖器拭子及其他各类物品，这类检材多含有精子及阴道上皮细胞，属男、女个体成分的混合物； （二）多人受伤的现场血迹，凶器、当事人身上或衣物上的血痕，多为混合血痕；,(三）咬痕拭子含有咬者的口腔上皮细胞和被咬者的皮肤细胞； （四）指甲垢，含有本人和被抓者的细胞； （五）血衣有另一个人的汗液、唾液或尿液。,四、检验的步骤,（一）首先要确证检材是否为混合斑； （二）如果为混合斑，则要确定由哪几种成分组成、组成的个体数等； （三）确定混合斑中各组成成分的遗传标记，进行个人识别。,五、注意事项,由于混合斑所测出的遗传标记是混合斑各组成成分遗传标记的总和，只有在与参照样本比较的情况下，才能推断混合斑各组成成分的遗传标记。 尽可能了解案情，提取相关人员的血液（痕）、唾液（斑）等检材。 尽可能同时同一条件下检测，进行对比推断。,案例,（1）如某一个嫌疑人强奸一个女子，现场提取的精液/阴道液混合斑，某一STR基因座DNA分型结果为3、5、9、10； （2）受害人血液基因型为3、9，则推测精斑基因型为5、10； （3）若嫌疑人的基因型为5、10，则不能排除其为作案人。,第二节 精液与阴道液混合斑检验,是物证检验中最常见的混合斑，常见于性犯罪案件。 检验的目的主要是检测精液的遗传标记，确定嫌疑人的基因型；少数要求确定阴道分泌液的遗传标记，认定受害者。,一、混合斑的确证,(一) 精斑的确证利用精斑的确证试验 (二) 阴道液斑的确证 1. 细胞学检查 2. 阴道肽酶测定,1.细胞学检查,斑痕浸液离心，沉淀物涂片，HE染色结果： （1）阴道上皮细胞：大而扁平、形态不规则、胞浆红染，有的为己完全角化无核。 （2）若同时查见精子，为阴道分泌液与精液的混合斑。 可根据嗜碘试验将富含糖原的阴道上皮细胞与口腔粘膜上皮细胞相鉴别。,嗜碘试验,斑痕沉淀物涂片干燥，加12滴Lugols碘液 ，或将玻片翻转盖在盛有Lugols碘液的小皿上，23min后镜检。 阴道上皮细胞被碘染成红褐色或深黄褐色，口腔粘膜细胞不着色。 注意：男性尿道口上皮细胞也呈碘染色法阳性，故在检查阴茎上有无阴道上皮细胞附着时需慎重。,2.阴道肽酶测定,肽酶（Peptidase）催化肽键水解的酶，阴道肽酶（vaginal peptidase,Vp）能水解L-缬氨酰基-L-亮氨酸及其他二肽底物. 仅存在于女性生殖道分泌液中，包括输卵管和子宫内膜分泌液、子宫颈管粘液及阴道粘膜分泌液中，与年龄、性活动及月经周期无关。,阴道肽酶测定：,用淀粉凝胶电泳检测，近正极有一条Vp蓝紫色谱带。 Vp检测阳性率64 ，阴性不能否定阴道 液存在。 在阴道液斑中，Vp的检出期限为7个月。 Vp不存在于血液及其他人体液中，月 经血及精液等均不影响其检出。,二、混合班中精液成分的个人识别 强奸案件现场提取的精斑多数混有阴道液。阴道液也能测定ABH血型物质，一些具有多态性的蛋白和酶，从阴道脱落上皮细胞也能获得DNA进行多态性分析。,混合斑所测出的遗传标记是精液与阴道液遗传标记的总和，鉴定混合斑，应取受害人和嫌疑人的血液、唾液等检材做参照样本。对于已婚的被害人，提取其丈夫的对照样本。,混合斑鉴定三类方法比较,（一）对比推断法,1. DNA分型 混合斑个人识别的常规技术：STR基因座分型技术 对混合斑直接提取DNA进行STR基因座分型，结果会得到男性案犯和女性受害人的混合分型图谱，单个基因座的等位基因数目可能超过3个。 直接与案犯和受害人的参照样本分型结果比对进行判定。,2. ABO 血 型 测 定,中和试验 测定混合斑和受害人唾液（斑）的血型及分泌状态，进行对比分析，推测混合斑中精液的ABO血型。 若混合斑中精液的ABO血型与嫌疑人的不同，则可否定嫌疑人；如相同，则不能否定。 若受害者为非分泌型，可从混合斑中判断嫌疑人的血型； 若受害者为分泌型，通过比对，在一定程度上可推断嫌疑人的血型,混合斑中精液ABO血型的判定 (表一),混合斑中精液ABO血型的判定 (表二）,注：se非分泌型；Se分泌型,注意事项： 结合相关案情 被害者没有的血型物质可认为来自精斑 混合比例影响，注意多处取材。,（二）分离精液和阴道液组分进行检测,进行混合斑DNA分型，关键获得纯净的精子DNA。 1.差异提取法分离精子和阴道上皮细胞DNA 从混合斑中提取精子DNA，目前最常用差异提取法(differential extraction)，或称两步消化法(two-step lysis)。,差异提取法 精子细胞核膜蛋白质富含二硫交联结构，对去污剂及外源性蛋白酶有相当强抵抗作用。 在混合斑检材中加适量TNE缓冲液、SDS和蛋白酶K，37水浴，3h。 去除基质后，离心，上清液含消化的阴道上皮细胞DNA，沉淀物即为精子。,沉淀物以TNE缓冲液洗涤数次，加适量TNE缓冲液、SDS、蛋白酶K和DTT(二硫苏糖醇)， 56孵育过夜 在DTT的作用下二硫键断裂，精子细胞膜破裂，即可获取精子的DNA 笫一步消化的上清液提取阴道上皮细胞DNA 第二步消化的上清液提取精子的DNA,实际操作中并非每次都能保证理想地分离精子和阴道上皮细胞。如果现场混合斑中阴道上皮细胞数量远大于精子时，常会造成消化不完全，分离到的精子细胞DNA仍然是混合物；有时过度消化又可能消化掉一部分精子，导致精子DNA的损失和减少。,提取混合斑DNA前，有必要做常规镜检。 根据精子的多少确定取检材量，精子较多1cm2左右的检材；精子偏少2cm2以上 根据精子和阴道上皮细胞的比例，结合经验对笫一步消化的时间、温度、试剂的浓度作出适当的调整。,为消除二步消化法可能分离不纯的影响，一般都应从混合斑第一步消化后的上清液中提取阴道上皮细胞的DNA，从第二步消化液中提取精子细胞的DNA，分别进行DNA分型，与受害者和犯罪嫌疑人的DNA比对，排除女性成分的干扰。,2激光捕获显微切割技术分离精子和阴道上皮细胞 激光捕获显微切割技术( laser capture microdissection，LCM) 是一项利用激光在显微镜下从组织切片中俘获并切割单一类型细胞群或单个细胞的技术。,操作过程：首先在组织切片上覆盖一层透明的膜，在显微镜下观察该组织切片，选择某一特殊细胞后，开启脉冲式红外激光束，使膜融化变得粘性很强，等到冷却后该位置的细胞就被牢固地粘附在膜上从而分离细胞。 用LCM技术可以收集有限的检材，排除干扰物质，使一些现有技术无法检测成功的检材也能检测成功。,有实验结果显示，采用常规的STR分型技术，25个的阴道上皮细胞能得到有效的检测结果，精子细胞却需50100个。 可能是由于精子细胞是单倍体，而切割收集无法保证均衡地收集两种单倍体，实际操作中应尽可能多的收集精子细胞。 若能结合LCM的优点与单细胞DNA分型技术，对于强奸案中精子和阴道上皮细胞的分离以及轮奸案中不同男性的DNA分型等均会很有意义。,1. Y染色体DNA分析 Y-STR是目前混合斑检验中精液个人识别的首选多态性遗传标记。 Y-STR分析较常染色体STR分析优越之处在于： 可确证检材中男性DNA的存在与否，以确定检材性质。 为男性特有。理论上，不需要分离男女成分，即可获得混合斑中男性成分的遗传标记，与犯罪嫌疑人直接比对，解释结果更为简单。,（三）检测精液特有的成分,不需用二步消化过程，避免了二次消化对男性DNA造成的损失，提高检测阳性率。由于Y-STR分型的灵敏度高，即使遇到无精子或者少精子的混合斑也能进行分型（对混合斑精液中的上皮细胞及白细胞等进行分型）。 Y-STR呈男性伴性遗传，不与其他染色体重组，除突变外，在父系的所有男性个体中，包括兄弟、父子、叔侄、堂兄弟和祖孙等都具有相同的Y-STR单倍型，因此可利用父系亲属的参考样本进行犯罪嫌疑人的排除推测。,可以确定犯罪嫌疑人的人数 对于单拷贝的Y-STR基因座，每一个体只有一个等位基因；如果在多个Y-STR基因座均检测出2个片段，则提示犯罪嫌疑人至少是2人，这对于轮奸案件的分析很有意义。,精子细胞比体细胞更稳定，对外界环境的抵抗能力强，有报道对保存25年的阴道拭子进行Y-STR分型获得成功。 单个Y-STR基因座的遗传差异度多数为0.50.7，实际检案中往住采用复合扩增，检测多个Y-STR基因座，提高鉴别能力。,三、混合斑中阴道液成分的个人识别,（1）有些案件，需要对混合斑中女性成分作个人识别。床单上混合斑确定案发现场； （2）犯罪嫌疑人阴茎龟头拭子或冲洗液中查出女性基因型，是证明嫌疑人涉案有力证据。,案例,一例强奸幼女案，犯罪嫌疑人诉混合斑是与幼女母亲发生性关系时所留，并控告被人污告。后鉴定证实女性DNA与幼女的基因型相同，从而认定了该强奸幼女案。 另一例强奸案，女性阴道拭子、内裤上均未检见人精斑，现场嫌疑人床单上检见人精斑，但嫌疑人一口咬定该精斑是其以前所留，不承认是该次强奸所留。结果在床单的混合斑中检出受害者DNA。认定了强奸事实。,有些性犯罪案件，可能检不出精斑，若能在嫌疑人的衣服或外阴部位检见阴道上皮细胞，确证存在阴道液(斑) ，检测其遗传标记，如果与受害者一致，则对认定嫌疑人有重要意义。,在检查嫌疑人时，应用生理盐水冲洗阴茎，收集冲洗液，沉渣涂片；或用载玻片对包皮腔、阴茎龟状沟作涂片，检查有无脱落的阴道上皮细胞。 混合斑进行DNA分析时，通常应用二步消化法。用第一步消化后的上清液提取女性DNA，进行常染色体STR多态性分析，是目前对阴道分泌液进行个人识别的主要方法。,四、轮奸案混合斑检验,差异提取DNA技术只能将阴道上皮细胞同精子分离，不能分离来自不同男性的精子。 STR分型可出现3条或3条以上的等位基因条带。,轮奸案的现场勘察，应注意提取多处检材或一份检材不同部位的斑痕，分别进行DNA提取和扩增分型，尽可能找到来自单个个体的精斑，以最后确定各犯罪嫌疑人的基因型。 混合斑中，几个犯罪嫌疑人精液的含量有时差别很大，造成精液成分特异性片段的密度或峰高值的个体差异，有时能确定精液的个体，为案件侦破提供线索。,多数Y- STR基因座的PCR产物只有1条带，若出现2条以上的带，可以认为存在有2个以上男性的精液。 在轮奸案中，确定是否轮奸、轮奸人数、排除或指控嫌疑人等方面， Y- STR均较常染色体STR标记有明显的优胜之处。,第三节 多个体血液混合斑检验,在凶杀、斗殴等案件中，会遇到含有两个个体成分以上的混合血样。 混合血斑的提取与一般血痕提取相似，除了提取现场可疑血液混合斑外，还要提取受害人和嫌疑人的血液作对照样本。 按血痕检验步骤，利用血痕确证试验及种属试验证明为人血痕后，进行个人识别。,一、混合斑的ABO血型测定,测定血痕的ABO凝集原和凝集素，当凝集原和凝集素矛盾时，可判断血痕为多人血混合。,混合血痕 ABO血型组合,2、4、6、7、8号血痕可确证为多人血， 1、3、5、9号血痕不能得出判定结果。 ABO血型测定结果对多人血的识别和检出效力较低，通常只作为初筛排查项目。,二、混合斑的DNA分析,STR多态性分析法灵敏度高、识别能力强，在混合血痕个体识别中的作用日渐增强。尤其是荧光标记STRs复合扩增技术，不仅灵敏度高、信息量大，而且可以进行定量分析，是目前解决混合样品个体识别的有效手段。,从不同个体血液混合斑提取DNA进行PCR-STR分型，实质上可视为在一个个体的STR扩增产物的基础上，附加了另一个人或多人的STR扩增产物。 检材的前处理、DNA提取以及PCR扩增与一人血痕的DNA检测方法相同。 对现场提取的检材证明为人血痕后提取DNA，同时分别提取疑为混合者的DNA，进行检测分型。,(一)确定是否为混合斑, 根据每个STR基因座峰的数目，如果出现2个以上峰（排除多个STR基因座中仅一个基因座出现的三带型模式的情况），尤其是多个STR基因座同时存在超过2个峰的图谱，可判定此斑痕为混合斑； 根据各个STR基因座图谱的相对峰高，正常情况下杂合子的两个峰的峰高比应该大于60%，stutter峰高与其主峰峰高比小于15%，如果不符合这种规律则提示混合斑的存在。,混合血斑DNA检验额外峰的出现 01*1为嫌疑人血样；02*2为混合斑；03*3为被害人血样。 02*2在以上三个基因座均检测到三个峰，且有01*1和02*2出现的等位基因。,（二）确定等位基因峰 等位基因片段大小应在等位基因分型标准物（ladder）0.5bp的范围内，同一样本进行复合扩增的基因座的每个等位基因峰相对ladder的漂移应大致恒定。,（三）确定构成混合物的组分数,确定混合斑中组分的数目对于后续的计算非常重要。一般而言，对于二组分构成的混合斑，单个STR基因座分型会出现1个、2个、3个或4个等位基因（图17-2）； 如果出现5个或者6个等位基因则提示至少有3个组分； 如果等位基因数目超过6个，则提示有4个以上组分。,(四)推断混合DNA样品基因型组合并与受害人或犯罪嫌疑人基因型比对 根据混合样品分型图谱中各等位基因组成及峰面积情况，推测所有可能的基因型及组合。 将分析的各种可能基因型组合与受害人和/或犯罪嫌疑人的基因型进行对比。 先确定已知个体的基因型，如犯罪嫌疑人的基因型与剩下的基因型组合不相符，则排除其嫌疑。反之则不能排除。,（五）统计分析,根据有无考虑等位基因峰高或峰面积，分为两种计算方法：无限制组合的似然率法和限制组合的似然率法。 1. 无限制组合的似然率法（the likelihood ratio method using the unrestricted combinatorial approach） 这种方法不考虑峰高和峰面积，仅是列出能够产生给定混合斑DNA图谱的所有组合，计算各种组合相应的Pr(E|Hp)和Pr(E|Hd)。,2. 限制组合的似然率法 该法除考虑等位基因的数目和类型，还考虑各个等位基因峰高（peak height）和峰面积（peak area），排除掉一些不可能的基因型组合。 结合