兔抗人红细胞免疫血清的制备.doc

兔抗人红细胞免疫血清的制备 摘要：目的 制备兔抗人红细胞免疫血清并鉴定其效价。方法 将经过生理盐水洗涤、离心、去上清后配成的红细胞悬液皮下多点（10处）注射于家兔靠近淋巴结处，在20天内经过免疫间隔时间的不同后，心脏采血并分离血清，倍比稀释、经过灭火补体与不灭活补体的凝集试验和溶血试验来判断兔抗人红细胞免疫血清的效价。 结果 凝集试验在(+)1:64抗血清稀释处出现凝集,溶血试验在1:512稀释处出现少量凝集。结论 在凝集试验中抗血清的效价为1:64.关键词：兔抗人红细胞血清 凝集试验抗体分子是生物学和医学领域用途最广泛的蛋白质分子，抗体作为疾病预防、诊断和治疗的重要生物制剂已有百余年历史。抗体在医药生物技术领域中的应用日趋广泛，地位越来越重要，而抗体的制备技术也是众多研究者们关注的问题，目前制备多克隆抗体主要是通过免疫动物所得，但是怎样才能制备得到高效价的抗体呢，免疫血清效价的高低受多重因素的的影响，免疫的途径及免疫的时间不同和分离的彻底与否都会影响抗血清的效价。本组通过免疫时间的不同来免疫家兔，并用 凝集实验和溶血试验来判断抗体效价，快速经济的制备抗血清制备方法为实验教学使用提供帮助， 更好的了解和加深抗原抗体反应及抗体效价的鉴定和影响因素 。1 材料和方法 1.1实验对象 选用健康、适龄、健壮、无感染的家兔1.2实验材料 生理盐水 人红细胞 采血针 止血带 碘液 酒精 棉签 真空管 水平式离心机 水浴箱 注射器 试管 吸管实验分组 三个大组（1个班一个大组） 4人一组 实验过程和方法1、 颗粒性抗原的制备 （2%5%RBC的制备）（1）静脉采血2-3ml，注入抗凝管中，轻轻混匀。（2）洗涤RBC 将上述抗凝血移至10ml试管中，加入NS 6-7ml，混匀， 2500r/min离心5min,去上清。重复上述操作三次，最后一次去上清后，将红细胞配制成2%5%的RBC悬液。二 免疫家兔2、取上述RBC悬液1ml免疫家兔。免疫部位：静脉、皮内、皮下等。每只兔子免疫810点，每点0.1ml左右。每隔24天免疫一次。 1班免疫时间表：从11月1日起开始免疫 共20天 每隔2天免疫一次第一次：11月1日 第二次 ：11月4日 第三次：11月7日 第四次： 11月10日第五次 ：11月13日 第四次：11月16日 第七次：11月19日2班免疫时间表:每隔3天免疫一次第一次：11月2日 第二次：11月6日 第三次：11月10日 第四次：11月14日第五次：11月18日 第六次：11月21日3班免疫时间表：每隔4天免疫一次第一次：11月3日 第二次：11月8日 第三次：11月13日 第四次：11月18日 第五次：11月22日三、对已免疫的家兔心脏采血和分离血清3、心脏采血10ml，凝固后，分离血清（2000转/min,5分钟)。4、取两支小试管并以A、B标记之，将上述血清一半加入A管，另一半加入B管。将A管置于56水浴箱30分钟（灭活补体）。5、抗血清效价的鉴定。凝集试验和溶血反应凝 集 反 应 实验原理 指颗粒性抗原(RBC)与相应抗体特异结合，在适当电解质存在下，形成肉眼可见的凝集现象试管凝集试验过程 1.取洁净小试管10支，排列于试管架上，依次编号。2. 向各管中加入生理盐水200ul。3.向第一支试管中加入A管血清200ul，充分混匀，吸出200ul放入第二管，混匀后取出200ul加入第三管中，如此类推直至第七管，混匀后取出200ul弃去。第10管不加血清，为生理盐水对照管。至此，第19管的血清稀释度分别为：1：2，1：4，1：81：512。这种稀释方法称为连续倍比稀释法，为免疫试验中常用的稀释方法。4.向每管加入200ul 2%RBC悬液，此时每管的液体总量为400ul ，血清稀释度又增加1倍。5.摇匀，置37 30min。(取出试管1500r/s 30秒)观察结果。 试管凝集操作程序(倍比稀释法)管号 12345678910NS200200200200200200200200200200血清 200200200200200200200200200200RBC 200200200200200200200200200200终稀释度 1/41/81/161/321/641/1281/2561/5121/1024-结果判断选择适当的光暗对比背景，先不要振摇，观察管底凝集物的范围和上清液的浊度。然后轻轻摇动试管，注意观察凝集颗粒的大小、均匀度等。每一试管的观察，都应与对照管进行比较。盐水对照管诮无凝集现象，轻轻摇动试管则RBC分散成均匀混浊；而凝集块则沉于管底，轻摇时不易散开，凝集程度通常以“+”表示：“4+”很强，全部RBC凝集，凝集块全部沉于管底，液体澄清。“3+”强，RBC大部分凝集并沉于管底，液体稍混浊。“2+”中等强度，RBC大约一半凝集，液体较混浊。“+”弱，仅少量RBC凝集，液体明显混浊。“-”不凝集，液体混浊与对照管相同。只要待测血清管出现“2+”以上的凝集现象，即可判断为反应阳性；以出现“2+”凝集的最大稀释度为待测血清的抗体效价。溶 血 试 验实验原理 溶血反应是指补体参与的抗体致红细胞的溶解反应.参与反应的成分有红细胞、抗红细胞抗体，也称溶血素、补体。 溶血反应实验过程 1.取洁净小试管8支，排列于试管架上，依次编号。2. 向各管中加入生理盐水200ul3. 向第一支试管中加入血清200ul，充分混匀，吸出200ul放入第二管，混匀后取出200ul加入第三管中，如此类推直至第七管，混匀后取出200ul弃去。第八管不加血清，为生理盐水对照管。至此，第17管的血清稀释度分别为：1：2，1：4，1：81：128。这种稀释方法称为连续倍比稀释法，为免疫试验中常用的稀释方法。4. 向每管加入200ul 2%RBC悬液，此时每管的液体总量为400ul ，血清稀释度又增加1倍。5. 摇匀，置37 30min。观察结果。管号 12345678910NS200200200200200200200200200200血清 200200200200200200200200200200RBC 200200200200200200200200200200终稀释度 1/41/81/161/321/641/1281/2561/5121/1024-观察结果时，应先观察对照管结果是否正确。对照管应不溶血，在对照管结果全部正确前提下观察待测血清管的结果，以出现完全溶血作为抗体的效价。6 结果经统计1、2班凝集试验抗血清最高效价为1:512。 本班本组凝集试验结果：在1:41:128血清稀释度 处均出现凝集现象，1:128稀释度处 仅有少量凝集为“+”而1：64处有一半凝集，液体较浑浊，而空白对照管中无凝集现象产生，通过目测，“+”为稀释度1:64处，则抗血清的效价为1:64。7讨论本班鉴定的抗血清效价都比1、2班的都低，造成这样的结果 可能是因为 1、 免疫间隔时间较长，是家兔机体产生的抗血清较少 2、 免疫部位的不同以及免疫不到位3、 操作过程不够认真，分离得到的抗血清不够纯4、 凝集试验过程中 灭火补体时间不够，导致部分被溶血而使凝集的很少5、 免疫兔子腹部淋巴结时，针头穿进腹膜下进到腹腔而使部分血清被消化排除使家兔的免疫应答减弱而产生的抗体少6、 免疫兔子时针头穿破皮肤而未发觉 造成血清注射量减少造成抗体产生减少参考文献何艳嫦 钟俊东 兔抗人血清制备与效价