基因诊断课件

,南方医科大学 基因工程研究所,基因诊断,如何进行产前诊断？,家族史：孕妇父母为姨表亲近亲婚配，表型正常，育有男女各一，家族中仅该孕妇为白化病患者，其兄正常 白化病：酪氨酸酶缺乏，导致黑色素生成障碍,患者32岁，白化病患者，现宫内妊娠19周，2003年11月17日入院。,白化病与常规产前诊断思路,白化病是一种遗传缺陷，全身性白化病属常染色体隐性遗传方式。局部白化病为常染色体显性遗传，眼白化病（皮肤、毛发均正常）可为伴性隐性或常染色体隐性遗传。 如果我们把决定酪氨酸酶的基因称为A，则正常人的基因型是AA或Aa，而白化病人的是aa，白化病人没有A基因，就没有酪氨酸酶。 白化病遍及全世界，总发病率为1/100001/20000。对白化病目前尚无有效的治疗方法，因此应以预防为主。禁止近亲结婚是重要的预防措施之一。对此病也可作产前诊断。在妊娠45个月时，通过胎儿镜取胎儿一小块皮肤，在电子显微境下检查胎儿是否为白化病，以避免患儿的出生，达到优生的目的。,白化病基因诊断思路,基因诊断介绍,概述 基因诊断的常用方法 基因诊断在临床的应用 我国基因诊断的发展,基因诊断即是指应用现代分子生物学和分子遗传学的方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对人体状态和疾病作出临床诊断或辅助诊断的方法。,概 述,Molecular diagnosis Gene diagnosis Gene testing,一、基因诊断的对象,外源DNA：病原生物的侵入 内源DNA： 先天遗传性疾患 后天基因突变引起的疾病 其 它,遗传物质DNA,基因诊断适用于,INFECTIOUS DISEASES Cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr virus (EBV), Hepatitis B virus, Hepatitis C virus, HIV-1 INHERITED DISEASES BRCA1/2 ,Cystic Fibrosis ,Factor II ,Factor V, Fragile X Syndrome ONCOLOGY,基因诊断的意义：,早期检测 例如家族性腺瘤息肉基因（APC） 常提示与结肠癌的发生密切相关。 诊断、分型 例如鉴别不同类型的白血病 预后 例如肿瘤抑制基因p-53的突变常预示着 肿瘤有恶性增殖和浸润的倾向。 治疗 例如利用抗体阻断基因产物，从而抑制 肿癌的生长。,基因诊断的特点,高针对性 高特异性 高灵敏度 适用性强，应用范围广,基因诊断技术已经显著地提高了人们的寿命。利用基因诊断技术，人们可以进一步确证诊断结果，并指导医生进行适当的治疗；也可以帮助一些夫妇避免生下有严重疾病的婴儿，或者鉴别一些对疾病具有高危易感的人群。,对基因诊断的赞成与反对,对成人的Alzheimers disease和一些肿瘤进行的基因诊断的商业化，是对基因诊断争论的焦点。因为这些基因诊断是对健康成人（无症状人群）进行的，鉴别他们是否会因为有某种家族性疾病的背景，从而具有对此疾病的高度易感性。,但基因诊断仅仅是给出一个人发展成这种疾病的可能性。基因诊断最大的局限性在于它很难解释阳性结果，因为一些人携带有与疾病相关的基因突变，但并不发病。,基因诊断的前景,未来10年中，基因诊断将从目前占现代疾病检测中的0.5%扩大到占全部诊断检测的8-10%，创造可观的经济效益。,基因诊断的常用方法,PCR,Molecular hybridization,Nucleic acid Sequence,在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件下，就可以在不同的分子间形成杂化双链。 这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。,核酸分子杂交(hybridization),DNA-DNA 杂交双链分子,不同来源的DNA分子,probe,probe,核酸分子杂交的应用,研究DNA分子中某一种基因的位置 测定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 是基因芯片技术的基础,探针的种类 基因组DNA 探针 cDNA探针 寡核苷酸探针 RNA 探针,理想探针的特征： 标记带有示踪物 单链核苷酸链 高度的序列特异性 长度不等 以基因编码区设计 灵敏度高,探针的标记物,放射性标记物 32P，35S，125I，3H 非放射性标记物 生物素，地高辛 荧光素， 酶， 金属,第1步，生物素和地高辛标记的探针在杂交板中与靶mRNA或者标准mRNA杂交,第2步，杂交后的产物转移到链霉亲和素包被的96孔板中，杂交后靶mRNA被捕获,第3步，加入AP标记的抗地高辛抗体，然后加入AP底物显色，酶标仪读取结果,第4步，绘制mRNA标准曲线，计算标本中靶 mRNA的含量,探针的标记方法,放射性同位素标记法 缺口平移法(Nick translation) 随机引物延伸法(Random primer labelling) 末端标记法(End labelling) 非放射性标记法 酶促标记法、化学标记法,病 名,常用的基因诊断的探针,核酸分子杂交方法,液相杂交：将待检测的核酸样本和核酸探针同时溶于杂交液中进行反应，然后分离杂交体和未反应游离的核酸探针，分析结果。 固相杂交：把欲检测核酶样本先结合到某种固相载体上，再与溶解于溶液中的核酸探针进行杂交反应，漂洗去除未参加反应游离的探针，再分析结果 Southern印迹杂交法 Northern印迹杂交法 斑点杂交法（点杂交） 菌落杂交法 原位杂交法,Southern blot,-英国科学家Southern首创 基本原理是：硝酸纤维膜或尼龙滤膜对单链DNA的吸附能力很强，当电泳后凝胶经过DNA变性处理，覆以上述滤膜，再于其上方压上多层干燥的吸水纸，借助它对深盐溶液的上吸作用，凝胶上的单链DNA将转移到滤膜上。转移是原位的，即DNA片段的位置保持不变。转移结束后，经过80烘烤的DNA，将原位地固定于膜上。,放射自显影照片,核酸杂交的基本过程,制备样品 制备探针 分子杂交 检测分析,从待检测组织样品提取DNA或RNA DNA或RNA经酶切消化 酶切片段的电泳分离 凝胶变性处理后转膜,（1）制备样品,（2）制备探针,基因探针（probe）就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA或合成的寡核苷酸。,（3） 杂交,预杂交：用非特异的核酸溶液封闭膜上的非特异性结合位点。 杂交：由于转印在膜上的核酸分子已经是变性的分子，所以杂交过程中只需变性标记好的探针，再让探针与膜在特定的温度下反应，然后洗去未结合的探针分子即可。,（4）检测,检测的方法依标记探针的方法而异 放射性同位素标记的探针：需要用放射自显影来检测其在膜上的位置； 生物素等非同位素方法标记的探针：需要用相应的免疫组织化学的方法进行检测。,核酸杂交基因检测流程示意图,待测核酸制备,待检核酸滤膜固定化,预杂交,杂交,去除未杂交探针,检测杂交信号,加入标记的探针,探针标记,制备探针片段,限制性酶切图谱直接分析法,类型：1、点突变导致限制性位点的改变 2、基因内部大段DNA序列的改变,定义：应用特异性探针和限制性内切酶，直接对存在于疾病基因内部的突变进行检测，称为限制性酶切图谱直接分析法。 前提：疾病基因的改变已经阐明,点突变导致限制性位点的改变,原 理：有些疾病的发生，是由于基因内单一碱基的改变引起，当此突变正好发生在限制性内切酶识别位点时，会导致内切酶图谱的改变，根据这一改变，综合其它因素，可对疾病的发生诊断 实例分析：镰刀型红细胞性贫血,MST II 识别位点： CCTGAGG 正常珠蛋白基因： 5CCTGAGG3 镰刀型贫血 ： 5CCTGTGG3,Mst酶切位点(GCTNAGG),5,3,正常基因,突变基因,1.15kb,1.35kb,镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析,0.2kb,1.15kb,1.35kb,正常人,突变携带着,患者,镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析,M,M,M,M,M,正常Hb,镰刀型贫血Hb,1.1kb,0.2kb,1.3 kb,AA AS SS,1.3kb,1.1 kb,基因内大片段DNA序列的改变,原理：由于基因内DNA片段的缺失或插入，使疾病基因的限制性片段长度与正常基因之间产生差异 实例分析： 0地中海贫血。其-Hb基因的3端缺失 0.6kb长的基因片段，使原来仅次于两侧的Bbl II限制性位点间的距离缩短,AA AS SS,4.2kb,5.2kb,正常-Hb,0-地中海贫血,5.2kb,4.2kb,1985年，Kary B.M创建了聚合酶链反应(polymerase chain reaction)技术，简称PCR技术。这是一种在体外由引物介导的DNA序列酶促合成反应，可以增加靶基因的拷贝数达百万倍，极大的提高了检测灵敏度，被广泛的应用于分子生物学的各个领域。,聚合酶链式反应,PCR技术对靶基因的扩增,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,一、基本工作原理,模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+,二、PCR体系基本组成成分,三、PCR的基本反应步骤,（一）目的基因的克隆 （二）基因的体外突变 （三）DNA和RNA的微量分析 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析,四、PCR的主要用途,几种重要的PCR衍生技术,（一）反转录PCR技术 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术,实时PCR技术原理,PCR/单链构象多态性分析 (single strand conformation polymorphism, SSCP) PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在。,正常人,纯合突变,杂合突变,Leber 病患者 PCR/SSCP分析,+,指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量基因探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）,基因芯片技术的概念,由于在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术如显微光蚀刻、显微打印等，且常用硅芯片作为固相支持物，所以称为基因芯片技术,基因芯片的分类,原位合成芯片 （In situ synthetic GeneChip） Affymetrix公司,DNA微集阵列 （DNA microarray） 斯坦福大学 Patrick Brown研究小组,基因芯片技术基本原理,基本原理是核酸分子杂交，即依据DNA双链碱基互补配对、变性和复性的原理大规模集成的固相杂交,以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息,基因芯片的制备与检测原理,Scanner,microarray,“Hybridize”,arrayer,Microarray fabrication Sample preparation Molecular hybridization Detection and analysis,一、芯片的制备,Gene probes （cDNA、DNA）,Ready-to-use microarray,or,arrayer,DNA芯片图解,Microarray: top view,Microarray: side view,Probes Adhesion layer Substrate,Sample cells,Extract RNA or DNA 2) RT or PCR amplification 3) Fluorescent labeling,Reference cells,Sample ready,combine,Labeled RNA or DNA (Sample ),Labeled RNA or DNA (Reference),2),1),3),1),2),3),二、基因表达谱双色标记,RNA Isolation,Raw sample contains biochemical contaminants which need to be removed (protein, DNA, cellular debris),mRNA quality has the largest effect on the success of the experiment,三、分子杂交,1) hybridize,Apply sample,2) rinse,四、检测分析,Laser 1,Laser 2,Detector 1,Detector 2,芯片的扫描,五、图 像 处 理,Detector 1,Detector 2,False-color differential image,图 像 分 析,（3）calculate ratios,杂交结果的聚类分析,表达谱聚类分析软件 Treeview,基因芯片技术,核酸序列分析,化学裂解法 (Maxam-Gillbert法),DNA链的末端合成终止法 (sanger法),一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法),基本原理,基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。 分析前，用同位素标记DNA的5末端，经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。,二、DNA链末端合成终止法,三、DNA自动测序,采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。,DNA自动测序,金标准,第三节 基因诊断在临床的应用,直接诊断 - 直接检查致病基因本身的异常 间接诊断 -当致病基因未知，或致病基因虽然已知但其异常尚属未知时，可以通过对受检者及其家系进行连锁分析，以推断前者是否获得了带有致病基因的染色体。,基因异常,基因缺失 基因突变 基因突变又包括单个碱基置换、微小缺失或插入。,目前能开展的基于DNA的基因诊断,Alpha-1-antitrypsin deficiency (AAT; emphysema and liver disease) Amyotrophic lateral sclerosis (ALS; Lou Gehrigs Disease; progressive motor function loss leading to paralysis and death) Alzheimers disease* (APOE; late-onset variety of senile dementia) Ataxia telangiectasia (AT; progressive brain disorder resulting in loss of muscle control and cancers) Gaucher disease (GD; enlarged liver and spleen, bone degeneration) Inherited breast and ovarian cancer* (BRCA 1 and 2; early-onset tumors of breasts and ovaries),Hereditary nonpolyposis colon cancer* (CA; early-onset tumors of colon and sometimes other organs) Charcot-Marie-Tooth (CMT; loss of feeling in ends of limbs) Congenital adrenal hyperplasia (CAH; hormone deficiency; ambiguous genitalia and male pseudohermaphroditism) Cystic fibrosis (CF; disease of lung and pancreas resulting in thick mucous accumulations and chronic infections) Duchenne muscular dystrophy/Becker muscular dystrophy (DMD; severe to mild muscle wasting, deterioration, weakness) Dystonia (DYT; muscle rigidity, repetitive twisting movements),Fanconi anemia, group C (FA; anemia, leukemia, skeletal deformities) Factor V-Leiden (FVL; blood-clotting disorder) Fragile X syndrome (FRAX; leading cause of inherited mental retardation) Hemophilia A and B (HEMA and HEMB; bleeding disorders) Huntingtons disease (HD; usually midlife onset; progressive, lethal, degenerative neurological disease) Myotonic dystrophy (MD; progressive muscle weakness; most common form of adult muscular dystrophy),Neurofibromatosis type 1 (NF1; multiple benign nervous system tumors that can be disfiguring; cancers) Phenylketonuria (PKU; progressive mental retardation due to missing enzyme; correctable by diet) Adult Polycystic Kidney Disease (APKD; kidney failure and liver disease) Prader Willi/Angelman syndromes (PW/A; decreased motor skills, cognitive impairment, early death) Sickle cell disease (SS; blood cell disorder; chronic pain and infections),Spinocerebellar ataxia, type 1 (SCA1; involuntary muscle movements, reflex disorders, explosive speech) Spinal muscular atrophy (SMA; severe, usually lethal progressive muscle-wasting disorder in children) Thalassemias (THAL; anemias - reduced red blood cell levels) Tay-Sachs Disease (TS; fatal neurological disease of early childhood; seizures, paralysis) 3/99,基因诊断举例,地中海贫血 由于珠蛋白基因缺失或突变导致某种珠蛋白链合成障碍，造成链或链合成失去平衡而导致的溶血性贫血，称为地中海贫血，简称地贫。 根据合成障碍的肽链不同，将地中海贫血分为地贫和地贫2类。,重型-地中海贫血：出生后即严重贫血，肝脾肿大。生长缓慢，反应迟纯。,地贫,- 在我国南方较常见。 - 迄今为止已发现了170多种突变类型，其中10多种为缺失型，其余均为点突变。 - 对地贫的基因诊断主要就是点突变分析。 PCR结合限制性内切酶酶解 （- 适用于RFLP及小片段缺失） 等位基因特异性PCR （- 适用于已知点突变）,沙眼衣原体,沙眼衣原体可引起人类地方性沙眼，是一种最常见的可预防的致盲原因。还可引起泌尿生殖道感染，是西方发达国家最常见的性传播疾病之一。 传统检测沙眼衣原体的标准方法是体外细胞分离培养，敏感性为70-80%,基因诊断的主要方法是PCR法 扩增的目的基因主要有质粒、衣原体主要外膜蛋白和16S rRNA的基因。 质粒：沙眼衣原体带有一隐性质粒，拷贝数为10个左右。 衣原体主要外膜蛋白：基因全长1200 bp .,肿瘤（结肠癌）,结肠癌是由于正常结肠上皮发生病理性转化形成腺瘤样息肉，最终形成侵袭性的癌。特征是结肠内有成百上千个腺瘤样息肉，若不及时治疗，最终发展为结肠癌。,肿块型 浸润型 溃疡型,常规诊断：X线、B超、结肠镜、血清癌胚抗原（CEA）,基因诊断常用方法：PCR-SSCP；蛋白质印迹法。 APC（结肠腺瘤样息肉）基因突变失活是多数结肠癌的早期事件，因此，对腺瘤样息肉病人作APC基因的检查，有助于预测发展为结肠癌的可能性。,亲 子 鉴 定,-通过人类遗传基因分析