生物化学第14章核酸的物理化学性质和第15章核酸的研究方法课件

第14章 核酸的物理化学性质,(Physical and chemical properties of nucleic acid),一、核酸的水解 二、核酸的酸碱性质 三、核酸的紫外吸收 四、核酸的变性、复性及杂交,一、核酸的水解,核酸可被水解的位点有磷酸酯键和糖苷键，其中糖苷键更易被水解。,核酸的酸水解,嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定，对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键。DNA在pH1.6于37对水透析可完全除去嘌呤碱；在pH2.8于100加热1h，也可完全除去嘌呤碱。 为了水解嘧啶糖苷键，需要较高的温度。用甲酸（98%100%）密封加热至1752h，无论RNA或DNA都可以完全水解，产生嘌呤碱和嘧啶碱，缺点是尿嘧啶的回收率较低。改用三氟乙酸在155加热60min（对DNA）或80min（对RNA），嘧啶碱的回收率显著提高。,核酸的碱水解,RNA的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸。 DNA的磷酸酯键则不易被碱水解。这是因为RNA的核糖上有2OH，在碱作用下形成磷酸三酯。磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生核苷2，3环磷酸酯。该环磷酸酯继续水解产生2核苷酸和3核苷酸。 DNA一般对碱稳定，若在1mol/L NaOH中加热至100 4h，可以得到小分子的寡聚脱氧核苷酸。,RNA的碱水解,核酸的酶水解,水解核酸的酶种类很多。非特异性水解磷酸二酯键的酶为磷酸二酯酶，如蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。专一水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶。另外还有非特异水解糖苷键的糖苷酶。,核酸酶的分类,按底物专一性分类：作用于RNA的称为RNA酶（ribonuclease，RNase）；作用于DNA的称为DNA酶（deoxyribonuclease，DNase）。 按对底物作用的方式可分为核酸内切酶（endonuclease）和核酸外切酶（exonuclease）。少数核酸酶既可内切又可外切。,核酸酶的分类,按磷酸二酯键断裂的方式可将核酸酶分为两类，一类断裂磷酸二酯键后磷酸保留在5位，一类磷酸保留在3位。 作用于双链的为双链酶，作用于单链的为单链酶。核酸外切酶有53方向切割的，也有35方向切割的，分别称为53外切酶和35外切酶。还有对特定核苷酸序列部位进行切割的（限制性内切酶）。,二、核酸的酸碱性质,碱基的解离,胞嘧啶的解离,碱基的解离,尿嘧啶的解离,胸腺嘧啶的解离,碱基的解离,腺嘌呤的解离,鸟嘌呤的解离,核苷的解离,核苷中由于戊糖的存在，碱基的解离常数有所下降，说明糖的存在增强了碱基上可解离基团的酸性。,核苷酸的解离,核酸中磷酸基的解离,核苷酸的解离曲线,核苷酸的解离曲线,尿苷酸的碱基的碱性极弱，实际上测不出其含氮环的解离曲线，故不能形成兼性离子。,小牛胸腺DNA的滴定曲线,从中间往两边滴为曲线，非缓冲区较宽。 从两边往中间滴为曲线，非缓冲区较窄。,这种情况是DNA双链分子解链导致的,三、核酸的紫外吸收,嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸、核酸在240290nm有强烈的吸收，最大吸收值在260nm附近。 紫外吸收是实验室中最常用的定量测定DNA或RNA浓度的方法。对于纯的样品，只要测出260nm的A值即可计算出浓度。通常A值为1相当于50g/ml双链DNA，或40g/ml单链DNA或RNA。 测定紫外吸收值还可以鉴定核酸溶液的纯度。纯DNA的A260/A280应大于1.8，纯RNA应达到2.0。若低于此值说明含有杂质。,四种核苷酸的紫外吸收曲线,摩尔磷吸光系数,有时核酸溶液的紫外吸收以摩尔磷的吸光度来表示。摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。先测定核酸溶液中的磷含量及紫外吸收值，然后求出摩尔磷吸光系数。 式中A为测得的吸光度，c为磷的浓度，L为比色杯的厚度，W为每升溶液中磷的重量（克）。,DNA的增色效应和减色效应,一般天然DNA的(P)为6600，RNA为77007800。单链核酸的(P)比双链核酸的大，核苷酸单体的(P)更大。双链DNA变性成单链后(P)值增大，称为增色效应；复性后(P)值减小，称为减色效应。这是因为双链结构使碱基对的电子云发生重叠，减少了对紫外光的吸收。,DNA的紫外吸收光谱,1.天然DNA 2.变性DNA 3.核苷酸总吸光度值,四、核酸的变性、复性及杂交,核酸的变性,核酸的变性就是双链之间的氢键断裂，成为单链。变性主要是双链DNA变成单链，也可以是单链RNA分子内的局部双链变成单链。使核酸变性的因素有高温、过酸过碱、变性剂等。常用的核酸变性剂有尿素、甲醛。,DNA变性示意图,DNA分子的熔点Tm,在DNA分子的热变性中，随着温度的升高，当温度达到一定值后，双链开始解开，然后有一个迅速的解链，成为无规线团，变性的温度区间很窄，我们把双链DNA解开一半时所需的温度称为该DNA的熔点（Tm）。DNA的Tm一般在8295之间。,DNA分子的热变性曲线,DNA分子的热变性曲线,异质的DNA变性温度范围宽，均质的DNA变性温度范围窄。,bacterial DNA,Viral DNA,影响DNA分子Tm的因素,（1）GC含量：GC之间有3个氢键，所以GC含量越高Tm越高。通过测定Tm值，可以推算出DNA中GC的含量，其经验公式为:,影响DNA分子Tm的因素,（2）介质中的离子强度：一般说离子强度低时Tm低，变性温度范围较宽；离子强度高时Tm高，变性温度范围较窄。,GC对含量与熔点的关系,Pneumococcus 肺炎链球菌 S. Marcescens 粘质沙雷氏菌 M. phlei 草分支杆菌,GC对含量与熔点的关系,RNA的热变性曲线,RNA只有局部的双螺旋，所以其Tm较低，变性温度范围较宽。不管是DNA还是RNA，加入甲酰胺可降低其Tm值。双链RNA的变性曲线几乎与双链DNA相同。,1.一种浮萍的18SrRNA 2.酵母的杀伤RNA（双链）加甲酰胺 3.同2，但无甲酰胺,DNA的复性,变性DNA在适当条件下，可以使两条分开的单链重新缔合成双链DNA，这个过程称为复性（renaturation）。将热变性的单链DNA骤然冷却，DNA不能复性，只有缓慢降温才能使热变性的DNA复性，这个过程又称为退火（annealing）。,不同DNA的复性曲线,核酸杂交,核酸杂交是以已知的异源DNA或RNA片段为探针，检测与之互补的DNA或RNA的存在。多数情况下是对探针进行标记，少数情况下标记的是被检测的DNA或RNA。,第15章 核酸的研究方法,(Research methods of nucleic acid),一、核酸的分离、提纯和定量测定 二、核酸的超速离心 三、核酸的凝胶电泳 四、核酸的核苷酸序列测定 五、DNA聚合酶链反应（PCR） 六、DNA的化学合成,一、核酸的分离、提纯和定量测定,DNA的分离,真核生物细胞中的染色体DNA与碱性的组蛋白结合在一起，成为核蛋白（DNP），DNP溶于水和浓盐溶液（如1mol/L NaCl），但不溶于生理盐水（0.14mol/L NaCl）。利用这一性质，可将细胞破碎后用浓盐溶液提取，然后用水稀释至0.14mol/L，使DNP纤维沉淀出来。用玻璃棒将DNP纤维缠绕在棒上，再经多次溶解和沉淀以纯化DNP。,DNA的分离,用水饱和的苯酚抽提，DNA溶于上层水相，变性蛋白质沉淀于两相的界面上或停留在酚相中。如此反复操作以除净蛋白质。将含DNA的水相合并，在有盐的条件下加2倍体积的冷乙醇，将DNA沉淀出来，用乙醚或乙醇洗涤沉淀。用此方法可得到纯的DNA。 用RNase处理除去残留的RNA 。为了得到大分子的DNA，应防止核酸酶和机械力对DNA的破坏。,RNA的分离,分离RNA时要特别注意防止RNase对RNA的降解。RNase无处不在，且耐高温，不易灭活。 制备RNA通常需要注意3点： 所有用于制备RNA的玻璃器皿都要经过高温烘烤，塑料用具须经高压灭菌，不能高压灭菌的器具要用0.1%焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC，RNase的不可逆抑制剂）浸泡处理，再煮沸以除净DEPC。 在破碎细胞的同时加入强的蛋白质变性剂（如盐酸胍）。 在提取和纯化RNA的试剂中加入RNase的抑制剂（如RNasin）。,RNA的分离方法,目前最常用的制备RNA的方法有两个： 1用酸性胍盐提取，然后用苯酚和氯仿多次抽提除去蛋白质。异硫氰酸胍是极强烈的蛋白质变性剂。此法用于小量制备RNA。 2用胍盐/氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离心。蛋白质密度1.89g/cm3，沉在底部。 分离poly(A)+ RNA通常采用寡聚胸腺嘧啶脱氧核苷酸亲和层析法。,核酸含量的测定,紫外分光光度法 定磷法 定糖法,二、核酸的超速离心,核酸密度的测定,将8.0mol/L的CsCl装入离心管中，DNA样品溶于CsCl溶液，加在离心管顶部。以45000转/分的速度离心16小时以上，此时离心管中形成线性的CsCl密度梯度，底部为1.80g/cm3，顶部为1.55g/cm3。DNA样品带停留在与之密度相应的位置。根据此位置的CsCl密度，可知DNA的密度。,核酸密度的测定,也可用一已知密度的DNA与待测密度的DNA一起离心，根据两条带的位置及已知DNA的密度，计算出待测DNA的密度。 式中和0分别为待测DNA和标准DNA的密度，r和r0分别为待测DNA和标准DNA区带位置与离心轴心的距离，为角速度（弧度/秒）。,测定DNA中GC含量,含GC多的DNA密度大，DNA中GC的百分含量与其浮力密度呈正比，所以测出了DNA的浮力密度就可以计算出其GC百分含量。,DNA中G-C含量与密度的关系,Salmon sperm 鲑鱼精子 Pneumococcus 肺炎链球菌 Serratia 沙雷氏菌 M. Phlei 草分支杆菌,溶液中核酸构象的研究,RNA只有局部双螺旋，它的浮力密度比双链DNA高，双链DNA又比蛋白质的密度高，双链DNA变性后成为单链，密度增加。利用密度梯度离心可以研究核酸分子的构象变化及其动力学过程。,纯化核酸,离心时加入溴化乙锭，离心后用紫外光照射，可观察到DNA条带的红色荧光。,三、核酸的凝胶电泳,(琼脂糖凝胶电泳),以琼脂糖凝胶为支持物时， DNA电泳的迁移率决定于以下因素： （1）核酸分子的大小。迁移率与分子量的对数成反比。 （2）胶浓度。胶浓度大则网孔小，核酸的迁移率变小。 （3）DNA的构象。一般条件下： 超螺旋的DNA迁移率 线性DNA 开环DNA 但凝胶中的溴乙锭浓度对此有影响。,琼脂糖凝胶电泳,在进行RNA电泳时，常