微生物实验实训报告

1 / 53 微生物实验实训报告 微生物实验实训报告 (一 ) 资源与应用微生物实习报告 学院：生命科学学院 专业：应用生物科学 学号：20160459020 姓 名： 毛 德 昌 酵母耐糖度、耐酒精度、耐酸度特性的检测 酵母菌是人类历史文明中被利用最早的微生物。酵母菌可以在缺氧的 环境中生存。酵母菌是一些单细胞的真菌，在自然也广泛存在，主要生活在偏酸的潮湿的环境含糖环境中。在酿酒业中广泛应用。酵母主要通过芽殖的方式繁殖后代。在不同的培养基浓度条件下酵母的的生长速率以及酵母的活性有所不同。利用血球计数板对发酵后的酵母进行计数，并计算酵母存活率，出芽率。 血球计数板被用来对人体内红、白细胞进行显微计数只用，也常用来对细、真菌、酵母等微生物计数，是一种常见的生物 学工具。每块计数板由 个同样的计数池。2 / 53 计数池两侧各有一支持柱，将特制的专用盖玻片覆盖其上，形成高的计数池。计数池画有长、宽各的方格，分为 9个大方格，每个大格面积为毫米毫米 =平方毫米 ;容积为平方毫米毫米 =立方毫米。其中，中央大方格用双线分成 25个中方格，位于正中及四角 5 个中方格是红细胞计数区域，每个中方格用单线划分为 16 个小方格。四角的 4 个大方格是白细胞计数区域，每个大方格用单线划分为 16 个中方格。血球计数板的计数区如下图 酵母死活计数和形态的观察可用吕氏美兰溶液对酵母进行染色。吕氏碱性美蓝染液 是一种无毒的染料，其氧化型呈蓝色，还原型为无色。用美蓝染液对酵母菌的细胞进行染色时，活细胞内的还原性物质能使美蓝由蓝色的氧 第 1 页 共 5 页 化型变为无色的还原型 。一、实验过程 选用三株酵母分别对其进行耐糖度，耐酒精度和耐酸度的特性进 行测定。 按照如下配方配制耐性发酵培养基 表二，酵母耐酒精度培养基（每瓶 200养基；注无水乙3 / 53 醇在接种前加入培养 接种种子液的配制以及接种 配制 子液培养基，用去皮的鲜土豆 20g，用 800去土豆，向滤液中加入 2g 葡 萄糖，定容至100装于 6支试管中，每支试管 15装好后放入灭菌锅中美军 30好菌后在超净工作台上从菌种管中挑适量的酵母菌接种于种子液中。接种好后 28培养48h。 发酵液的接种 培养好后现在显微镜下利用血球计数板对酵母染色后进行计数。记录活细胞和死细胞，将各个菌种液的活细胞浓度调成一致，向每个耐性梯度的培养基中接种入 1 28条件下恒温培养 48同样的方法对酵母进行计数。 二、实验结果 血球计数板计数公式： 4 / 53 1） 25 10000 B 50000）； A 表示五个中方格的总菌数； 第 2 页 共 5 页 注 ：（ 1）死细胞；（ 2）酵母菌体；（ 3）芽体 实验结果统计如下各表 表三，种子液酵母计数 表四，种子液酵母死亡率 将三株酵 母菌的活菌数调到浓度均为 9 10 个菌体，然后接种于三种耐性培养基的个梯度中，每个梯度 1每个梯度中接种 9 10个菌体。培养 48小时后计数结果如以下各表。 5 / 53 第 3 页 共 5 页 6 6 表五，酵母耐酸实验数据 第 4 页 共 5 页 微生物实验实训报告 (二 ) 微生物学大实验 实验题目：土壤微生物的分离纯化与鉴定 一 实验目的： 6 / 53 二 实验原理： 1. 培养基的制备、消毒与灭菌： 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或 积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。不同微生物对 求不一样，霉菌和酵母的培养基的 般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的 般为中性或微碱性的 ( 嗜碱细菌和嗜酸细菌例外 ) 。所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的 到合适的范围。 此外，由于配制培养的各类 营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱度所带来不利的影响。 7 / 53 2. 微生物的分离与纯化： 自然界中各种微生物混杂生活在一起，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。从混杂的微生物群体中获得只含有某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。土壤是微生物生活的大本营，所含微生物无论是数量还是种类都是及其丰富的。因此，土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，人们可以从中分离到很多有价值的菌株。本实验将采用平板划线分离法。 3. 平板分离技术与活菌计数： 值得指出的是从微生物群体中经分离、生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征等综合考虑。有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征 鉴定方能得到。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。 8 / 53 平板分离法主要有：（ 1）平板划线分离法，（ 2）稀释涂布平板法。后者除能有效分离纯化微生物外，还可用于测定样品中活菌数量。 平板菌落计数法是将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上；经过培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。统计菌落数，根据稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度。由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，平板上形成的每个菌落不一定是单个细胞生长繁殖而成，有的可能来自 2个或多个细胞。因此，平板菌落计数的结果往往比样品中实际细胞数低，这就是现在使用菌落形成单位（ 代以前用绝对菌落数来表示样品活菌含量的原因。 4. 分离菌株的鉴定： 微生物的分类鉴定是微生物的重要内容，一般从菌落特征、细菌特点及生理生化、分子生物学等方面进行鉴定。 各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。不同的细菌 分解大分子碳水化合物、蛋白质和脂肪的能力不同，所能发酵的类型和最终产物也不一样。不同细菌对营养的要求不同也说明了它们有不同的合成能力。所有这些都反映了它们是有不9 / 53 同的酶系统。 细菌的这种生化反应的多样性在自然界产生了两种结果：第一、使自然界所有的有机分子都有可能得到分解；第二、使不同细菌之间有了互相作用和互相依赖的基础。另一方面，微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一，细菌的生化反应的多样性也被人们作为细菌的鉴定和分类方法来利用，可以鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。 5. 生理生化反应： 微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪等不能直接利用，必须依靠产生的胞外酶将大分子物质分解后，才能被微生物利用。胞外酶主要为 水解酶，通过加水裂解大分子物质为较小化合物，使其能被运输至细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖，脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸，蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等，这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。 糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要，绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源，但10 / 53 是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差 异，有些细菌能分解某种糖产生有机酸 微生物实验实训报告（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳等），有些细菌只产酸不产气。 吲哚（ 甲基红（ 伏 柠檬酸盐（ 个实验的缩写，主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水细菌学检查。 吲哚试验是用于检测吲哚的产生，某些细菌可产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。对二甲基氨基苯甲醛遇吲哚形成玫瑰吲哚（红色）。但 并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。 色氨酸水解反应： 吲哚与对二甲基氨基苯甲醛反应： 6. 实验整体思路： 11 / 53 在确定取样环境之后，对微生物原样进行梯度稀释，产生合适的浓度进行涂板用于微生物的计 数。 染色并镜检，利用形态学方法对微生物做一粗略的定位。 根据镜检设计相关生理生化试验作进一步定位。 根据以上获得的信息确 定微生物类群并加以定位。 三 实验器材： 1. 实验菌种： 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 2. 培养基： 牛肉 膏蛋白胨培养基，马铃薯培养基，固体油脂培养基，固体淀粉培养基，葡萄糖发酵培养基试管，乳糖培养基试管（内装有倒置的德汉氏小管），蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基。 12 / 53 3. 溶液和试剂： 50%乙醇， 20%的甘油，硝酸银染色液、香柏油、二甲苯、美兰水溶 液，卢戈氏碘液，甲基红指示剂， 5%孔雀绿水溶液、 %番红水溶液，革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式（ 液， 95%乙醇，番红复染液，香柏油，二甲醇等。 4. 土样： 山东大学中心校区图书馆前光草坪内地表 10 5. 仪器和其他用品： 普通光学显微镜，擦镜纸，酒精灯，载玻片，双层瓶，接种环，试管架，镊子，滴管，二甲苯，香柏油，蒸馏水，盖玻片，吸水纸，无菌平板，无菌试管， U 型玻棒，解剖刀，无菌吸管等。 四 操作步骤： 13 / 53 （ 1）称量：按培养基配方依次准确地 称取药品。 （ 2）熔化：在沸水浴锅中或电炉上加热熔化。 （ 3）调 用 1 1 （ 4）分装：将溶化的固体培养基趁热加至漏斗上，装试管时，注意管口不要沾上培养基。液体分装装量不超过试管的1/4，固体分装装量不超过试管的 1/5，分装三角瓶的量不超过三角瓶容积的一半，半固体分装装量为试管的 1/3，灭菌后垂直待凝。 （ 5）加棉塞：培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能，然后包 扎一层牛皮纸。试管先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮纸，贴上标签，注明培养基名称、日期、组别。 2无菌水的制备。 14 / 53 （ 1）用量筒量取 90上棉塞，包扎牛皮纸。 （ 2）用 10管取 9于 10 支试管中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。 3器皿的准备。 （ 1）培养皿的包装：每 10套一包，用牛皮纸包扎。 （ 2）吸管的包装：首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用长纸条包扎、打结。 （ 3）玻璃涂布棒的包装：方法同吸管的包装。 （ 4）枪尖的包装：放入枪尖盒，牛皮纸包装。 4高压灭菌。 （ 1）将所要灭菌物品放入高压蒸汽灭菌锅内，根据需要设定灭菌温度和时间（一般 121， 20菌，若培养基中含有葡 萄糖等成分时， 113 ， 30如因特殊情况15 / 53 不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。 （ 2）灭菌完毕，将试管培养基搁成斜面，搁置的斜面长度以不超过试管总长度的一半为宜。培养基冷至 50左右，倒平板。 5微生物的分离与纯化。 （ 1）土壤稀释液的制备：称取 10g 土壤，放入灭好菌的无菌水中用玻璃珠打碎土壤，静置 30 10试管中，从中取 1液于装有 9菌水的试管中，充分震荡后依次操作，将 7 支试管按稀释倍数分别记作 0， （ 2）涂布平板：分别取 0 度， 5 度的试管中的土壤浸出液于细菌培养基平板上，用刮刀涂布均匀。再分别取 0度和 准备好的霉菌培养基平板上，涂布均匀。相同稀释度的浸液涂布 3 个平板。 （ 3）培养：将细菌培养基平板置于 37恒温箱培养 24h，将霉菌培养基平板置于 27恒温箱培养 3d。 16 / 53 （ 4）平板计数及菌落描述：将培养好的细菌进行平板计数（理想为每平板上不多 微生物实验实训报告 (三 ) 引言： 一、实习时间： 二、实习地点：食品发酵实验室（化学楼 119、 123）、食品学院实习基地 三、实习目的： 1、学习自制酸奶的方法，熟悉从酸奶中分离和纯化乳酸菌的一般方法。 2、掌握各类酸奶生产的基本工艺和要求。 3、学习奶酒的发酵过程、工艺流程，及 其注意事项。 17 / 53 4、对自己所学的科学知识进一步深化，提高实践能力，整体策划部署能力，动手能力，组织能力，团体协作能力，创新能力等方面也有一些提高。 四、实习内容： 为了获得最佳酵母菌发酵结果，我们通过对 源以及图书资料的搜索和查寻，查的产酯酵母广泛应用于白酒、黄酒、普通酒、醋、酱油中，另外，还应用于果汁中。 所以我们准备了三种菌种来 源材料：果皮、酒曲、保藏的酵母斜面。第一种方法是利用果皮做来源，将削下的果皮放入带玻璃珠的三角瓶充分振摇，梯度稀释，涂布于 脂培养基上。第二种方法是用各种酒曲做为菌种来源，将酒曲粉碎，称量，梯度稀释，而后涂布于 三种方法是利用保藏的酵母斜面作为菌种来源，用接种环在酵母斜面上取一环菌，而后用划线法接种于 用于实验。 经过大家的讨论后，一致 决定利用酵母斜面上的菌种，对其18 / 53 进行培养。因为利用酵母斜面上的菌种在此次实习中可以用到我们实验上所学习的知识，真正将知识用于实践，并在实践中得到巩固。但是，酵母斜面上的酵母菌制得的菌悬液浓度很大，所以在菌种筛选方面，我们将菌悬液 10 进制稀释到 1000数量级，各浓度涂布两个平板，另六个平板用于划线分离法进行菌种分离， 30度培养 24 到 48h，观察平板上的菌落生长情况。初选出酵母菌，将菌落照片后就进行显微镜观察，筛选到典型的酵母菌株，进行生化实验。将平板上的酵母单菌落接种保藏于斜面培养基（ ,30 度培养 48h 后， 4 度冷藏。将 面培养基上保存的酵母菌接种于培养液中培养，而后接种于豆芽汁发酵液中，进行发酵测产脂能力。 11 月 25 日我们按照讨论决定的方案进行了酵母菌的筛选实验，实验内容如下： 培养基的制备、分装、灭菌（分述在下文中） 在实习中共需要准备六种培养基： 养基、豆芽汁培养基、葡萄糖产酸产气培养 基、硝酸盐生化实验培19 / 53 养基、糖发酵实验培养基。各培养基配方如下： 1、 养基： 1%酵母膏， 2%蛋白胨， 2%葡萄糖， 2%琼脂。 2、 养基： 2%马铃薯， 2%葡萄糖， 22%琼脂。 秤取切成小块的马铃薯，加水煮烂（ 20八层纱布过滤，滤液中加入葡萄糖，最后加入琼脂。 3、豆芽汁培养基： 10%黄豆芽， 2%葡萄糖， 2%琼脂 洗净豆芽，加水煮沸 过滤。滤液加入琼脂，加热溶解后放入糖，搅拌使它溶解，补水至设定值。 4、糖产酸产气培养基：营养物（ %牛肉膏， 1%蛋白胨， %氯化 钠， %磷酸氢钠， %溴麝香草酚蓝）配方为 20g/1000馏水配制，。分装后加葡萄糖 %。 5、硝酸盐生化实验培养基： %牛肉浸膏， %白胨，（ 100养基加入 1 20 / 53 6、糖发酵实验培养基：营养物（ %牛肉膏， 1%蛋白胨， %氯化钠， %磷酸氢钠， %溴麝香草酚蓝）配方为 20g/1000馏水配制，。分装后加乳糖 %。 制备：由于第 6种培养基同第 4种培养基，则一组配制即可，再加上无菌水，共需制备六种，则将全班分成六个组，我们为第 4组，故配制过程如下： （ 1）天平调平。 （ 2） 准确秤取营养物（ 微生物实验实训报告配 390葡萄糖、蔗糖、乳糖各。 （ 3）将营养物放入搪瓷缸中，加入 390馏水，玻璃棒搅拌将其溶解。 （ 4） 不是，用氢氧化钠溶液调到。 分装： （ 1）取三个 250形瓶，每个锥形瓶中倒入 130上述溶液。 21 / 53 （ 2）将上述称好的葡萄糖、蔗糖、乳糖分别倒入三个锥形瓶中，摇晃锥形瓶使其溶解。 （ 3）将加入糖的营养液分别装入 12个试管中，每个试管用移液管放入 10 （ 4）将每两个葡萄糖、蔗糖、乳糖用牛皮纸扎成一捆，即每 6 个试管扎成一捆，写上班级、组别后待灭菌。 灭菌：将已经包扎好的试管放入灭菌箱中，进行灭菌待用。 以上就是我们组的制备过程，在这个过程中应该注意以下几点： 1、称量前天平要调平。 2、秤取营养物时应准确秤取。 3、溶解后注意调 4、量取培养液时要准确，特别是向试管中分装时要用移液22 / 53 管。 酵母菌的分离（详述分离方法，培养条件及观察到的菌落结果） 步骤过程： 1、倒平板：待 养基冷却至 50度左右后，按无菌操作法倒 12只平板（每皿约倒 15平置，待凝。 2、酵母菌稀释：取 19无菌水锥形瓶中，摇匀后再从锥形瓶中取 1入 1号管，依次进行，则管里酵母的浓度依次是 100 3、平板分离：依次从 101010板每个浓度涂两个。 4、划线法分离：用接种环从酵母斜面上取一环酵母，在酒精灯前按无菌操作法进行划线，将酵母接种于 6个平板中。 5、恒温培养：将 12 个培养皿平板置于 30恒温箱中培养2448小时。 结果： 23 / 53 观察菌落：出现了 4 种不同形态的菌落。 圆形，菌落大，表面光滑，湿润，突起，乳白色。 圆形，菌落略小，湿润，突起，质地均匀，呈乳白色。 椭圆形，菌落略小，湿润，突起，颜色均一，呈乳白色。 椭圆形，菌落大，湿润，突起，颜色均一，呈乳白色。 结果分析： 通过网上查阅资料显示，正常条件下大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。 啤酒酵母的菌落红酵母的菌落各种酵母菌的菌落。 将我们观察的结果与资料相比，确实符合大多数 酵母菌的菌落形态。 结论：观察到的是酵母菌落。 24 / 53 酵母菌的初步鉴定（包括革兰氏染色和糖代谢实验） 将平板上分离到的各菌 株进行简单染色后进行镜检 观察结果为： 球菌，各个细胞的形状比较规整。 结论： 通过菌体个体形态和菌落形态，初步确定出了一株酵母菌。 注意事项： 1、搬动显微镜时应一手握住镜臂，另一手托住底座，镜身保持直立，并紧靠身体，步态稳健。切记单手拎提， 以免目镜头从镜筒上掉出而砸坏。 2、各个镜面切忌用手涂抹，以免手上的油、汗污染镜面，造成发霉、腐蚀。 将初步确定的菌株进行生化实验 25 / 53 步骤过程： 用接种环从平板上挑取已分离的同一菌落接种于糖发酵管和硝酸盐生化管中，接种完后 30培养。 24 小时后观察结果。 与此同时，将平板上的酵母单菌落接种保藏于斜面培养基（ 30度培养 48小时后， 4度冷藏，待检其他特性。 结果： 验中并没有观察到，但硝酸盐管中变黄，则分析结果，可能是酵母菌生长不旺盛，导致即使产气也看不出来。 根据这一现象，能够说明该菌株具有产酸产气性能，确定此菌株确实是酵母菌。 3、发酵产酯实验（） 步骤过程： 26 / 53 （ 1）准确吸取 25酵液于 250形瓶中，加入 25 2滴酚酞指示剂，用 /L 的氢氧化钠滴至微红色，记下消耗氢氧化钠溶液的体积。 （ 2）将滴定后的发酵液转移至 250形瓶中，准确加入15上冷凝管，加热至沸回流 30 （ 3）取下冷却至室温，完全转移至 250量瓶中立即用/L 的盐酸溶液滴定至微红色刚好消失，纪录盐酸溶液的用量，记录总酯的含量。 结果： 氢氧化钠消耗体积： 盐酸消耗体积： 5析与结论：氢氧化钠消耗体积用来预估总酯含量，且其越大则总酯越少。由此可见 ，产酯量应该不少。 按公式：总酯 =（ 15 但是我们滴到 18不见结果，并且没有要到微红的迹象。可能是由于配制实验试剂时出现问题，导致没有测出总酯量。 27 / 53 五、总结 短短一周的微生物实习在紧张又有效率的节奏下顺利的结束了。这是我们自己在老师协助下并亲自动手连续完成的一些列实验，在其中感受到了很多平时和课上很少遇到的东西，有自主，有探索，有反思，有合作 短暂的实习转眼而过，回顾实习生活，我在实习的过程中，既有收获的喜悦，也有一些遗憾。喜悦是我们都在老师的指导下自主设计了方案并分工鲜明，合理 掌握每一步实验用时及时、准确测量数据，最终都得到了相应的结果。而遗憾那就是对实验有些方面的认识仅仅停留在表面，只是在看人做，听人讲如何做，未能够亲身感受、具体处理一些工作，所以未能领会其精髓。但时通过实习，加深了我对实验和微生物基本知识的理解，丰富了我的微生物实验的知识，使我对实验有了深层次的感性和理性认识。认识到要做好实验，既要注重理论知识的学习，更重要的是要把实践与理论两者紧密相结合。更进一步体会到了“实践是最好的老师”的深刻意义。 微生物实验实训报告 (四 ) 28 / 53 微生物学实习报告 姓名：余洋 专业：临床 日期：2016/10/12 成绩： 合作者：金泽健 陈锦超 显微镜号： 实验室：第一实验室 教师姓名： 无菌操作技术 【摘要】无菌操作技术是整个微生物实验的关键环节，无菌操作技术掌握的熟练程度直接影响着 以后整个实验过程。为了认识无菌操作的重要意义，学习基本的无菌技术。我们通过实验室空气微生物学检查，手上细菌的接种和培养，紫外线杀菌试验来熟悉无菌操作技术。 实验结果表明： 1)培养皿在空气中暴露的时间越长，培养皿上形成的菌 落就越多。 2)由于洗手后未擦干 所形成的培养皿上的菌落数比未洗手造成的菌落多。 3)照射紫外线的部分菌落数为 0，而未照射部分有大量菌落形成。 【关键词】无菌操作；空气沉降；紫外线杀菌；细菌的接种 引言 29 / 53 医学微生物的实验操作对象大多为致病的微生物。由于各种微生物的致病力与传染途径不同，故对不同微生物实验操作也不同。作为实验者必须严格遵守实验操作规则，精益求精把握好实验中的一些细节问题。既要防止自身感染。又要杜绝将病 原微生物散布于实验室外的一切可能，而无菌操作技术就是实验成功和防止感染的保证。 本实验结合微生物学实验课“可观测性”的特点，结合三个实验进行细菌形态观察，向学生介绍肉眼可见的细菌菌落。使同学对工作环境无菌及无菌操作在微生物实验中的重要作用加深了解。 实验材料和方法 1. 实验仪器和材料 仪器：接种环、载玻片、酒精灯、培养皿等 材料： 气及手上细菌 2实验步骤 实验室空气微生物学检查： 采用自然沉降法检查空气中的细菌。取普通培养基 8 个，将盖打开，分别暴露空气 5， 10， 15， 20， 25， 30， 35， 40分钟，然后盖上盖，于平板底部贴上标签，置 37温箱培养，观察菌落生长情况。 手上细菌的接种培养： 30 / 53 取普通培养基一个，用笔在培养基的底部划线成 2 等份。并编号 1、 2（洗手和不洗手）。在无菌间或酒精灯旁进行，先用右手食指涂 1号格，再将右手 食指用自来水清洗后涂 2 号格。于 37培养后结果观察。 紫外线杀菌试验： 取普通培养基一个，用笔在培养基的底部划线成 2 等份。并编号 1、 2。以无菌操作【 1】的手法，用接种环分别接种 ， 2 部分。 将接种好的培养皿半开放置紫外灯下照射 40 分钟。盖 上培养皿盖，放 37温箱中培养。观察结果，从培养箱中取出培养皿，观察其上细菌生长情况，从菌苔特点判断是否有杂菌污染，以判断无菌操作是否合格。 姓名：余洋 专业：临床 日期：2016/10/12 成绩： 合作者：金泽健 陈锦超 显微镜号： 实验室：第一实验室 教师姓名： 试验结果 1. 实验室空气微生物学检查 31 / 53 从培养皿上看，洗手后未擦干所形成的培养皿上的菌落数比未洗手造成的菌落多。 3. 紫外线杀菌 微生物实验实训报告试验 讨论 1. 实验室空气微生物学检查 空气不是微生物存在的自然环境，但空气中带有细菌也常是培养基制备污染的来源。实验室内学生多，大声说话，咳嗽由上呼吸道喷出的微生物可播散到空气中。空气中的细菌在重力的作用下不断向下沉降，降落到培养皿中 ，曝露时间也长，培养皿中降落的细菌也越多，因此形成的菌落也越多。 2. 手上细菌的接种培养 洗手后未擦干所形成的培养皿上的菌落数比未洗手造成的菌落多。可能原因是由于只用自来水洗而且未擦干，可能并未洗掉手上的细菌，反而带来了大量水中的杂菌。且手上的水在划线时也沾染到培养基上，增加了水分，可能使培养环32 / 53 境更适合细菌生长。 3. 紫外线杀菌试验 紫外线消毒在临床上常用，但其穿透力弱，不宜透过普通玻璃、纸张、尘埃等。因此直接照射紫外线的细菌死亡，培养基上没有菌落出现。而有玻璃盖阻挡的部分菌落生长良好。 （另：结合其他组数据可知：紫外线照射时间越长，菌落数越少，灭菌效果越好。） 实验不足 在实验方案设计上，实验 2中应该添加上洗手后擦干的操作，而且最好都用洗手液洗。 另外结果记录中应该添加上别组数据，研究不同曝光时间下紫外线杀菌效果。由于数据不方便收集只能放弃 。 姓名：余洋 专业：临床 日期：2016/10/12 成绩： 合作者：金泽健 陈锦超 显微镜号： 实验室：第一实验室 教师姓名： 注意事项 33 / 53 刮取细菌。否则易损伤细菌且易产生微生物气溶胶引起感染。 养皿应底部朝上倒置放在培养箱 中。因为皿盖朝上正向放置时， 37条件下培养基中水分挥发可凝集在皿盖上，形成液滴，液滴滴落在琼脂表面，易引起培养物污染或单菌落连接在一起成片生长。 参考文献： 【 1】医学免疫学与病原生物学实验教程，王月丹主编，北京大学医学出版社， 附录 【 1】无菌操作技：用接种环取菌时，先将接种环以 45 度角插入酒精灯火焰的内焰处烧灼片刻，再移至外焰烧灼片刻，之后将接种环横过来水平移动，烧灼全部镍铬丝部分。以无菌操作手法打开培养物，将烧灼灭菌的接种环在琼脂表面或试管壁上冷却 68 秒，取少许菌苔或菌液，同样以无菌操作的手法接种至新鲜培养基内。取菌时如果接种环过热，接触菌液或菌苔时易产生感染性气溶胶，引起自身感染或污染环境，也会杀 死菌种。接种应在火焰附近进行，蘸有细菌的接种环不能碰触衣物和操作台等其它物品。接种结束要立即将34 / 53 染菌金属丝用火焰灭菌，并将接种柄置于接种架上。所有无菌操作完毕，应将带有细菌物品妥善处理，并将其空间进行紫外线消毒。 微生物实验实训报告 (五 ) 实 习 报 告 实习名称系 别年级专业学生姓名指导老师 食品微生物检验实习 11 级食品科学与工程专业 王磊（ 1140905035） 王瑶琼、吴菲菲、黄大川 邵 阳 学 院 2016 年 12 月 10 日 一、实习时间、地点和 实习单位 016年 11月 18日 12 月 8 日 3 栋 104 微生物实验室和 3 栋 108 无菌室 阳学院生物与化学工程系 35 / 53 二、实习过程概述 动员大会 查找资料，制定实习计划表 上交计划表，领器材，清理台面，清洗， 烘干，包扎器材 配制细菌培养基 ， 灭菌，倒平板。放入 37恒温培养箱24h，检验是否灭菌彻底 制备试样 ，十倍稀释，接种 培养 观察，计数，清洗，烘干，包扎 配制察氏培养基，灭菌，倒平板。放入 37恒温培养箱 24h，检验是否灭菌彻底 11 25 制备样品。十倍稀释，接种。培养 观察 观察， 计数，清洗，烘干。包扎 36 / 53 配制察氏培养基，灭菌，倒平板。放入 37恒温培养箱 24h，检验是否灭菌彻底 11 29 制备样品。十倍稀释，接种。培养 观察 观察， 观察 观察 观察，计数，清洗，烘干。包扎 配制乳糖胆盐发酵管，灭菌，配制试样、接种，培养 观察是否冒泡 三、实习内容 检测样品：香干 采样的方法：随机抽样法。 取 25 225次进行十倍稀释。 实验原理：配制检验菌种培养基并包扎、消毒、灭菌；正确采集样品，处理样品（稀释、样品滴加、培养）；菌落观察与计数；数据处理、分析。 37 / 53 细菌的检测用 养基，酵母菌用察氏培养基，霉菌用察氏培养基，大肠菌群的检测用乳糖发酵培养基和 养基 香干中细菌含量的检测 数据记录： 表一：样品中细菌的含量 注：每个平板加入的稀释液 实验现象结果记录：细菌菌落颜色为白色，比霉菌和酵母菌落都要小，且形状多为圆形， 香干中酵母菌含量的检测 数据记录： 注：每个平板加入的稀释液 实验现象结果记录：酵母菌落颜色形状为白色表面细润的菌38 / 53 落，也存在少许红色 的菌落 香干中霉菌含量的检测 注：每个平板加入 1实验现象结果记录：在孟加拉红培养基上长出的霉菌菌落 ,霉菌菌落有菌丝 ,菌落的颜色有灰色、黑色、黄色等。但培养基上除了霉菌菌落以外已有酵母菌菌落，酵母菌菌落为粉红色。 香干中大肠菌群含量的检测 微生物实验实训报告 (六 ) 微生物学实验报告 实验一 普通光学显微镜的使用及细菌染色与形态观察 第一部分：显微镜的使用 一、目的要求 39 / 53 1熟悉普通光学显微镜的构造、油镜的使用原理和显微镜的维护方法。 2学会正确使用油镜观察细菌的基本形态和特殊构造。 3了解各种显微镜的主要特征。 二、实验原理 （一）光学显微镜的构造 微生物实验室中最常用的是普通光学显微镜，它的构造可分为机械部分和光学部分。 1、机械部分 普通复式光学显微镜的机械部分通常包括以下几个部分：目镜、镜筒、基座回转器、物镜、载物台、光圈、聚光器、光源、镜臂、细调节器、粗调节器等。 2、光学部分：目镜、物镜、聚光器、光圈、光源。 40 / 53 （二）放大倍数 标本首先经物镜放大，在目镜的焦距平面上形成一个实像，再经过目镜放大成最终的虚像。总的放大倍数是物镜放大倍数与目镜放大倍数的乘积。 物镜的放大倍数愈大，其工作距离（物镜镜头到标本片之间的距离）愈短，这时光圈就要打开得愈大。 显微镜的性能受物镜的分辨距离或分辨力所限制。分辨距离即透镜所能分辨的两个物点之间的最小距离，分辨距离愈小，透镜的分辨力愈高，物像也就愈清晰。因此常以分辨距离来衡量显微镜的 分辨力。 R= / 式中： 数值口径。 41 / 53 一些介质的折射率 介 质 空气 水 玻璃 香柏油 折射率 1 13 55 三、实验内容 （一） 材料：显微镜，香柏油，擦镜纸。 （二） 方法： 细菌很小，须使用油镜方可观察到。油镜是显微镜上最重要的部件之一，观察时与玻片非常接近，稍不小心即可压碎玻片，更严重的是损坏镜头 微生物实验实训报告，故必须极其仔细地学习油镜的使用42 / 53 方法： 1、为使低倍镜取得最适之光源，可将低倍镜头调节 到离载物台约 1聚光器提高，光圈完全打开，然后调节电压旋钮至视野最合适。 2、 滴一滴香柏油，固定于载物台上，用推动器调节到载物台正中。在双目侧视下，下旋粗调节器，使油镜头浸入油中几乎与标本片相接触。然后眼睛从目镜观察（如光线不足，可适当增大电源电压），徐徐上旋粗调节器至看到模糊物像之后，再用细调节器调节以使物像清晰。如镜头已离开油面还未看到物像，则再重新操作。 3、更换标本时应先提高油镜头，再更换玻片，切勿随意移动显微镜的位置。 4、油镜观察完毕后，按“显微镜保护”中（ 6）项处理。 5、最后将油镜各部分还原，聚光器下降，反光镜垂直于镜座，镜头转成八字形，以免与聚光器发生碰撞。 四、思考题 43 / 53 1、使用显微镜时为何调节下列构造？反光镜，光圈，聚光器，粗调节器，细调节器，镜头回转器。 答：聚光器的位置之升降可影响视野的明亮度，上升则视野明亮，下降则光线减弱。光圈的放大或缩小也可控制视野明亮程度。粗调节器和细调节器均是调节焦距的装置。镜头回转器为装置物镜和转换物镜之用。 2、使用不同放大倍数的物镜时，工作距离与光圈的关系。如何利用这一原理用好显微镜？ 答：物镜的放大倍数愈大，其工作距离（物镜镜头到标本片之间的距离）愈短。标本首先经物镜放大，在目镜的焦距平面上形成一个实像，再经过目镜放大成最终的虚像。总的放大倍数是物镜放大倍数与目镜放大倍数的乘积。 3、为何要选用与玻璃折射率相似的香柏油作为油镜的介质？油镜的原理是什么？ 答：香柏油只在使用油镜头时（ 100 倍物镜）使用，因为当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（ n= ）的折射率44 / 53 不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。当以香柏油（ n=）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明度，更重要的是通过增加数值孔径达到提高分辨率的目的。可见光的波长平均为 m。 当使用数值孔径为的高倍镜时，它能辨别两点之间的距离为 m；而使用数值孔径为的 油镜时，能辨别两点之间的距离则为 m。选用香柏油是因为它的折射率是 4、显微镜有哪几种？各自的主要特征是什么？ 答：光学显微镜中除明视野显微镜外，还有暗视野显微镜、相差显微镜和荧光显微镜；除光学显微镜外，还有电子显微镜。 暗视野显微镜：在普通光学显微镜载物台下安装一个暗视野聚光器即成暗视野显微镜。 相差显微镜：相差显微镜成像的原理和普通光学显微镜一45 / 53 样，所不同的是相差显微镜包括有环状光阑、装有相板的相差物镜和全轴调整望远镜三个特殊部分。 荧光显微镜：荧光显微镜的主要特征是以紫外线为光源，当照射到用荧光素标记的细菌时，荧光素吸收了紫外线的能量后，再发射出可见的橙、黄、浅绿色荧光。由于用荧光素标记的菌体各种结构中的溶解、吸附或化合情况不一，于是发出不同色调和亮度的荧光，从而可以观察细菌的不同结构。 电子显微镜：电子显微镜的基本结构和工作原理与普通光学显微镜非常相似，不同的是用电子流代替 光线，用电磁圈代替透镜聚焦。 第二部分：细菌形态学检查方法 一、目的要求 1、 了解不染色标本检查法，用悬滴法观察活细菌及 其动力。 2、 熟悉染色标本的制备过程，掌握革兰氏染色法及其结果判断，了解革兰氏染 46 / 53 色法原理。 3、 了解其它常用染色法。 二、实验原理 检查细菌形态的主要工具是显微镜，可根据不同目的将细菌染色或不染色进行镜检。常用的碱性染料有结晶紫、美蓝、碱性复红等。 染色法又分单染色法和复染色法两大类。单染色法即仅用一种染料着色，所有的细菌均被染成一种颜色，无鉴别细菌的作用。复染色法又称鉴别染色法，通常用二种或二种以上的染料着色，由于不同种类的细菌或同种细菌的不同组成结构对染料有不同的反应性而被染成不同的颜色，从而有鉴别细菌的作用。 2、 最常用的细菌复染色法是革兰氏染色法（ 通过革兰氏染色法操作，可把细菌分 成两大类：革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。凡能使第一种染料结晶紫保留蓝色的细菌叫革兰氏阳性细菌，凡被洒精脱色后染上对比颜料沙黄或稀释复红而呈红色的细菌叫做革兰氏阴性细菌。 47 / 53 三、实验内容 （一）染色标本的制备及观察 1、复染色法（革兰氏