医学课件微生物的营养与培养基

第四章 微生物的营养与培养基,Chap 4 microbial Nutrition and medium,营养（或营养作用nutrition) ： 是指生物体从外部环境摄取其生命活动所必需的能量和物质，以满足其生长和繁殖需要的一种生理功能。 营养物（或营养nutrient) ： 指具有营养功能的物质，常常还包括光能这种非常规物质形式的能源在内。 营养物提供生命活动的结构物质、能量、代谢调节物质和良好的生理环境。,营养和营养物,第一节、微生物的六种营养要素,微生物细胞的元素组成 主要元素（以大肠杆菌为例%） C（50）、N（14）、O（20）、H（8）、 S（1）、P（3）、K（1）、Ca(0.5)、Mg(0.5)、Fe(0.2) 微量元素（需要量10-4mol/L以下） Zn、Mn、Na（1）、Cl（0.5）、Mo、Se、Co、Cu、W、Ni、B 由这些元素再组成化合物。其中C/N一般是5:1。,元素在细胞内的存在形式,上述元素主要以水、有机物、无机盐的形式存在于细胞中： 1有机物：蛋白质、糖、脂类、核酸、维生素及其降解产物。 2无机物：1)参与有机物组成； 2)单独存在于细胞质内以无机盐的形式存在。 3、水：约占细胞总重70%90%，以游离水和结合水两种形式存在。 游离水：干重法可测得； 结合水：不易蒸发、不冻结、也不能渗透, 占水总量的17%28% 。,微生物细胞化学组成含量的变化,此组成可因菌种的种类、菌龄、培养基组成、培养条件、分析方法等而有所不同。,微生物细胞中几种主要元素的含量（干重）,微生物细胞干物质中矿质元素含量,一、 碳源 Carbon Source,一切能满足微生物生长繁殖所需碳元素的营养物，称为碳源。分无机碳源与有机碳源两大类。 凡必须利用有机碳源的微生物叫异养微生物。 凡能利用无机碳源的微生物叫自养微生物。 传统种类：糖类（单糖，饴糖） 淀粉（玉米粉、山芋粉、野生植物淀粉等） 麸皮 各种米糠等 代粮发酵：纤维素、石油、CO2、H2,微生物的碳源谱,糖类： 葡萄糖，果糖，麦芽糖，蔗糖，淀粉，半乳糖，乳糖，甘露糖， 纤维二糖，纤维素，半纤维素，甲壳素，木质素，等 有机酸： 乳酸，柠檬酸，延胡索酸，低级脂肪酸，高级脂肪酸，氨基 酸，等 醇类： 乙醇，等 脂类： 脂肪，磷脂，等 烃类： 天然气，石油，石油馏分，石蜡油 ，等 CO2 碳酸盐： NaHCO3， CaCO3，白垩，等 其他： 芳香族化合物，氰化物，蛋白质，肽，核酸,微生物可利用的碳源(化合物分类),异养微生物的常用碳源,糖类是最广泛利用的碳源，其次醇类、有机酸类、脂类。 在糖中，葡萄糖、果糖好于甘露糖、半乳糖；已糖好于戊糖；单糖好于多糖；纯多糖优于杂多糖（淀粉最好）。 一般不把蛋白质（含氨基酸）和核酸类物质作碳源。 对异养微生物来说，碳源是一种双功能营养物，同时作能源。,凡能提供微生物生长繁殖所需氮元素的营养源。也可分为有机氮源和无机氮源（如硝酸盐）。 一般地说，异养微生物对氮源的利用顺序是：“NCH O”或“NCH OXO”类优于“NH”类，更优于“NO”类，而不易利用的则是N2。 氨基酸自养型生物：不需要利用氨基酸作氮源的生物；（绿色植物和很多微生物） 氨基酸异养型生物：凡需要从外界摄取现成的氨基酸作氮源的生物。（动物和大量异养型生物）,二 、氮源 nitrogen Source,微生物的氮源谱,有机氮源：蛋白胨、黄豆粉、玉米浆 无机氮源：NH4NO3、(NH4)2SO4 气态氮源：大气N2,生理酸性盐和生理碱性盐,硝酸盐NO3 NH4+,蛋白氮必须通过水解之后降解成胨、肽、氨基酸等才能被机体利用，这种氮源叫迟效氮源。 无机氮源或以蛋白质降解产物形式存在的有机氮源可以直接被菌体吸收利用，这种氮源叫做速效氮源。 速效氮源，通常有利于机体的生长，迟效氮源有利于代谢产物的形成。,铵 盐 氨基酸 入胞 细胞物质 蛋白胨,豆 饼 蚕蛹粉,分解 入胞 细胞物质,诱导酶,诱导酶,三、 能源 energy Source,能源：能为微生物的生命活动提供最初能 量来源的营养源。 能源谱：,生长因子：是一类对微生物正常代谢必不可少且不能用简单的碳源或氮源自行合成的有机物，它的需要量一般很少。 作用：辅酶或酶活化所需。 培养基中生长因子来源： 酵母膏、玉米浆、麦芽汁等。 它与碳源、氮源、能源不同，并非任何一种微生物都须从外界吸收。根据微生物与生长因子的关系可将微生物分为以下几类： 1 .生长因子自养型：多数真菌、防线菌和不少细菌； 2 .生长因子异养型：乳酸菌、动物致病菌、支原体； 3 .生长因子过量合成型：其代谢活动会分泌出大量维生素等生长因子。如：阿舒假囊酵母产VB2。,四 、生长因子 growth factor,若干细菌所需要的维生素,维生素的生理功能,无机盐： 除碳、氮外的微生物需要的其他无机元素。 在配制培养基时，因天然成分、水、试剂中 含有，对有些需要量少的元素不需另加。 培养基中常加K2HPO4、MgSO4、FeSO4等。,五、无机盐,无机盐的生理功能,无机元素的来源和功能,六、水,1.几种生物的游离水含量： 人：60%； 海蛰：96%； 微生物： 孢子：霉菌孢子：39%； 细菌孢子：皮层70%，核心30%； 营养体：细菌：80%； 酵母菌：75%； 霉菌：85%。,2.水在微生物生命活动中的重要作用,原生质的重要组分； 优良溶剂；（物质进出细胞） 维持大分子结构的稳定； 参与生化反应； 重要的物理性质：如高比热；高汽化热； 高沸点；冰的密度小于水等，保证 生命活动的正常进行。,微生物对水的需要程度（水对微生物生长的影响）常用环境（或基质）中的水活度值（water activity, w）表示。所谓w就是水的有效浓度。 定义：水活度为在一定的温度条件下，溶液的蒸汽压（材料上部蒸气相中水浓度）与纯水的蒸汽压（即纯水上部蒸气相中水浓度）之比， 即：w=/ o 表示溶液的蒸汽压 o表示纯水的蒸汽压 在w为0.600.99的环境条件均有微生物生长，但对某种微生物而言，它对w的要求是一定的，微生物对水的需求有相当的变化程度。即微生物不同，其生长的最适w亦不同。,水活度值,几类微生物生长最适w,为了表示微生物生长与水的关系，有时也常用相对湿度（RH) 的概念（ w 100= RH ）；通常也用测定蒸气相中相对湿度的方法得知溶液或物质的水活度。,第二节、微生物的营养类型,营养类型是按能源和氢供体来划分，也可以按能源和基本碳源来分。（两种划分极少数情况下不一致） 以下四大类型微生物的划分不是绝对的，它们在不同条件下生长时，往往可以互相转变。,以C02作为唯一碳源或主要碳源，并利用光能，以无机物如硫化氢、硫代硫酸钠或其他无机硫化物作为供氢体将CO2还原成细胞物质，同时产生元素硫 光能 CO2H2S CH2O+2S+H2O 光合色素 光能自养型微生物包括蓝细菌（含叶绿素）、红硫细菌和绿硫细菌等少数微生物（含细菌叶绿素），由于含有光合色素，因而能使光能转变成化学能（ATP），供机体直接利用。,1、光能自养型微生物,2、化能自养型微生物 以CO2或碳酸盐作为唯一或主要碳源，以无机物氧化释放的化学能为能源,，利用电子供体如氢气、硫化氢、二价铁离子或亚硝酸盐等使CO2还原成细胞物质。 这类微生物主要有硫化细菌、硝化细菌、氢细菌与铁细菌。它们在自然界物质转换过程中起着重要的作用。,3、光能异养型微生物 以CO2为主要碳源或唯一碳源，以有机物（如异丙醇）作为供氢体，利用光能将CO2还原成细胞物质，红螺菌属中的一些细菌属于此种营养类型。 光能 2(H3C)2CHOH+CO2 CH3COCH3+CH2O+H2O 光合色素 光能异养型细菌在生长时大多数采要外源的生长因子。,4、化能异养型微生物 多数微生物属于化能异养型，其生长所需要能量和碳源通常来自同一种有机物。 根据化能异养型微生物利用有机物的特性，又可以将其分为下列两种类型： 腐生型微生物：利用无生命活性的有机物作为生长的碳源。 寄生型微生物：寄生在生活的细胞内，从寄生体内获得生长所需要的营养物质。 存在于寄生与腐生之间的中间过渡类型微生物，称为兼性腐生型或兼性寄生型。,第三节、营养物质进入细胞的方式,细胞膜是控制营养物进入和代谢产物排出的主要屏障。细胞膜以四种方式控制物质的运送。 一、单纯扩散（Simple diffusion) 又称被动运送（passive transport)，以通过物理扩散方式让许多水分子，非电离分子尤其是亲脂性的分子被动通过的一种物质运送方式。运送的物质有：O2、CO2、醇和某些氨基酸分子。,特点： 高浓度向低浓度； 不消耗能量； 不需要载体； 非特异性。,简单扩散（被动扩散）,二、促进扩散（facilitated diffusion),在溶质的运送过程中，须借助于膜上底物特异性载体蛋白的参与，不需要能量，将膜外高浓度物质运送至膜内，直至平衡为止。 如：酿酒酵母对各种糖、氨基酸、维生素的吸收。 这些载体蛋白具有酶的性质，一般通过诱导产生。,胞外 细胞膜 胞内,促进扩散（协助扩散）,主要存在于真核生物中。 特点： 高浓度向低浓度； 不消耗能量； 需要载体； 一般通过专一载体蛋白完成。,运输速率,浓度梯度,单纯扩散和促进扩散的比较,单纯扩散随浓度增加而线性增加，而促进扩散在一定浓度后出现平台,三、主动运输（active transport),特异性载体蛋白在运送溶质的过程中，发生构象变化，需耗能而逆浓度梯度进行运送。,主动运输特点：,1.是微生物吸收营养的主要方式 2.可逆浓度梯度运输，耗能 3.需载体蛋白，有特异性 4.运输有机离子、无机离子、氨基酸、乳糖等糖类 5. 需要特异性载体蛋白，需要能量来改变载体蛋白的 构象 6.亲和力改变蛋白构象改变耗能 单纯扩散、促进扩散、主动运输 ：被运输的溶 质分子不发生改变。,主动运输的机制：,使用质子(H+)和钠离子(Na+)梯度,1. 电子转移能被用来将质子泵出膜外 2. 质子梯度通过反运输机制将钠离子逐 出膜外 3. 钠离子与载体蛋白复合物相结合 4. 溶质结合位点的形状发生改变，而与溶质(如 糖和氨基酸)结合 5. 载体蛋白的构象发生改变，钠离子在膜内释放，随后溶质从载体蛋白解离,主动运输,四、基团移位（group translocation),是一种既需特异性载体蛋白又须耗能的运送方 式，但溶质在运送前后会发生分子结构的变化。 以葡萄糖（Glucose)为例，其特点是每输入一个 葡萄糖分子，就要消耗一个ATP的能量。运送的机制 是依靠磷酸转移酶系统，其运送的步骤为： 1 、热稳载体蛋白（Hpr, heatstable carrier protein)的激活。 2、 糖被磷酸化后运入膜内。,特点： 属主动运输类型 溶质分子发生化学修饰 定向磷酸化 需复杂的运输酶系参与 运输葡萄糖、果糖、甘露糖、嘌呤、核苷、脂肪酸等,甘露醇,甘露醇1磷酸,Group translocation,基团转位,主要存在于厌氧和兼性厌氧的细菌中，进行糖、脂肪酸、核苷和碱基等运输。,四种物质运送方式的比较,第四节、培养基,培养基：（medium or Culture medium)是一种人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合养料。 任何培养基都应具备微生物所需要的六大营养要素，且其间的比例是合适的，配制完毕应及时灭菌。 从不同的角度可对培养基进行分类。,一、选用和设计培养基的原则和方法,（一）4个原则 1 、目的明确：何菌种？何产物？是固态还是液态？是种子还是发酵培养基？ 2 、营养协调：各物质的浓度与配比，如 C/N比等。 3 、物理化学条件适宜：PH、渗透压、水活度、氧化还原势等。 4 、经济节约：废代好、粗代精、野代家、 烃代粮、纤代糖、国代进、简代繁。,适宜营养物质的选择,常见微生物氮源,常用的培养基中的无机盐及参考浓度（g/L）,物理化学条件适宜(如pH),微生物有最佳生长pH 细菌: pH7.08.0 放线菌： pH7.0 8.5 酵母菌: pH3.86.0 霉菌： pH4.06.0 微生物在生长过程中培养基pH值可能发生的变化 ： 在含糖基质上生长,会产酸而使pH下降， 在分解蛋白质和氨基酸时, 会产NH3而使pH上升， 以 (NH4)2SO4 作N 源 , 会过剩 SO42-, 而使pH下降， 分解利用阳离子化合物如：NaNO3, 会过剩 Na+ 而使pH 上升。,物理化学条件适宜(如pH),维持培养基pH的方法 使用磷酸缓冲剂：K2HPO4 /Na2HPO4 , KH2PO4/NaH2PO4 采用“备用碱” ：CaCO3 、CaHCO3 采用弱酸盐：柠檬酸盐、乳酸盐等 采用液氨或盐酸,生长谱法实验,如果我们要试的是某一微生物的碳源，则先准备一个不加碳源的琼脂培养基； 待融化并冷却至45度左右时，混入供试菌悬液，摇匀后倒成琼脂平板； 待其凝固后，将待试碳源，用镊子夹取少许并整齐地放在平板上； 经温箱培养适当时间后，凡在某碳源周围出现该菌的“生长”者，即为它可利用的碳源。 用同样原理也可寻找合适氮源和生长因子。,（二）4种方法,1 、生态模拟：在自然条件下，凡有某微生物大量生长繁殖的环境，则可认为该处一定具备该微生物生长繁殖所必须的营养和其他条件。 2、 查阅文献。 3 、精心设计。 4 、试验比较：试验的规模一般都遵循由定性到定量，由小到大等逐步扩大的原则。,二、培养基的种类,1、 天然培养基 这是一种利用动、植物或微生物体或其提取物制成的培养基，人们无法确切知道其中成分。 优点：取材方便，营养丰富，种类多样， 配制方便。 缺点：成分不稳定也不 清楚。,（一）按对培养基成分的了解来分,2、组合培养基,又称合成培养基或综合培养基。 是一类用多种高纯化学试剂配制成的， 各成分的量都确切知道的培养基。 优点：成分精确，重演性高。 缺点：价格较高、配制麻烦。,3、 半组合培养基,是一种既含有天然成分又含有纯化学试剂的培养基。又称半合成培养基。 琼脂未经处理的组合培养基也视为半组合培养基。 优缺点： 成分精确性、重演性、价格、 配制等介于合成培养基和天然培养基之间。,（二）按培养基外观的物理状态来分,1 、液体培养基：呈液体状态的培养基。 2 、固体培养基： 外观呈固体状态的培养基。 根据固体的性质又可把它分成4类： A.固化培养基：液体培养基中加入适量凝固剂； B.非可逆性固化培养基：凝固后不能再融化； C.天然固体培养基：天然固态基质直接配置； D.滤膜：微孔薄膜覆盖在营养琼脂等营养物上。 3 、半固体培养基：介于固态和液态之间的培养基。 （加0.5%左右琼脂） 4、脱水培养基：含有除水以外的一切成分的商品培养基。,培养基固化物琼脂与明胶的比较,（三）按培养基对微生物的功能来分,1、 选择性培养基 ：就是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基。 其功能是从混合菌样本中选取优势菌，从而提高该菌的筛选效率。 1)加富性选择培养基： 用作加富的营养物主要是一些特殊的碳源或氮源，如甘露醇、纤维素、石蜡油、糖液等。 2)抑制性选择培养基： 选择性抑制剂有染料、抗生素、脱氧胆酸钠、叠氮化钠等。 用于选择性的其他理化因素还有温度、氧、pH和渗透压等。,2、 鉴别性培养基 培养基中加有能与某一菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便的从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。 最常见的鉴别性培养基是伊红美蓝乳糖培养基，即E