细胞周期的调控（cellcyclins）

CELL CYCLE,第二节 细胞周期的调控,一、MPF的发现及其作用,1970s Rao和Johnson发现与M期细胞(Hela)融合的间期细胞染色体发生凝缩，称为早熟凝集染色体(prematurely condensed chromosome，PCC)。 G1期PCC为单线状，因DNA未复制。 S期PCC为粉末状，因DNA由多个部位开始复制。 G2期PCC为双线染色体，说明DNA复制已完成。 甚至不同类的M期细胞也可诱导PCC产生，说明M期细胞具有促进间期细胞进行分裂的因子，即成熟促进因子(maturation promoting factor， MPF)。,染色体超前凝集（PCC）,细胞融合与PCC(Premature chromosomal condense),人们猜测，在M期的细胞中存在着某种物质，它能够促进染色体的凝聚和细胞的分裂。后来，人们在不同类型的M期细胞中分别提取出了能够促进细胞分裂的的因子，统称为成熟促进因子(maturation promoting factor，MPF)。,处于第六期的爪蟾卵母细胞（RD前期I），具GV。,爪蟾卵子成熟过程,MPF的发现？,注射实验表明：孕酮诱导卵母细胞成熟；成熟卵细胞质中，含有卵母细胞成熟的因子，称做MPF。,MPF是一种使多种底物蛋白磷酸化的蛋白激酶； 主要含有p32和p45两种蛋白,二、p34cdc2激酶的发现及其与MPF的关系 1960s Leland Hartwell 芽殖酵母 1970s Paul Nurse 裂殖酵母 利用温度敏感突变株，发现许多与细胞分裂有关的基因(cell division cycle gene, CDC)。如,裂殖酵母cdc2、 芽殖酵母cdc28突变型在限制温度下无法分裂 wee1突变型则提早分裂，cdc25突变型细胞体积增大而不分裂 cdc2和cdc28都编码一个34KD的蛋白激酶，促进细胞周期的进行 其产物分别为p34cdc2 （G2/M）、 p34cdc28（G2/S或G2/M） weel和cdc25分别表现为抑制和促进CDC2的活性。,Fission yeast （裂殖酵母）,budding yeast （芽殖酵母）,Cdc 25 & Wee1 mutant,1980s Timothy Hunt发现海胆的卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周期振荡，命名为周期蛋白(cyclin A和B)。后来发现各类动物来源的细胞周期蛋白mRNA均能诱导蛙卵的成熟。 1988年Lohka将非洲爪蟾的MPF纯化。经鉴定MPF由32KD和45KD两种蛋白组成，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶。 进一步的研究发现MPF=Cdc2+clyclin B,1988年M. J. Lohka 纯化了爪蟾的MPF，经鉴定由32KD和45KD两种蛋白组成，二者结合可使多种蛋白质磷酸化。,MPF、Cdc和Cyclin的关系,MPF的生化成分：含有两个亚单位 MPF =Cdc2+cyclin （催化亚单位+调节亚单位）,后来Paul Nurse（1990）进一步的实验证明P32实际上是Cdc2的同源物，而P45是cyclinB的同源物，从而将细胞周期三个领域的研究联系在一起。 即MPF是由cyclin和CDC基因编码的依赖于cyclin的蛋白激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)，,Leland H. Hartwell,R. Timothy (Tim) Hunt,Sir Paul M. Nurse,2001年10月8日美国人Leland Hartwell、英国人Paul Nurse、Timothy Hunt因对细胞周期调控机理的研究而获诺贝尔生理医学奖。,三、细胞周期蛋白cyclin,特点：在细胞周期中呈周期性变化。含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白框（cyclin box），介导周期蛋白与CDK结合。（M期周期蛋白N端：破坏框；G1期周期蛋白：C端含PEST序列） 作用：激活CDK，引导CDK作用于不同底物。 已知30余种，在脊椎动物中为A1-2、B1-3 、C、 D1-3、E1-2、F、G、H等。 分为4类：G1型、G1/S型、S型、M型。,Destruction Box in Cyclins,不同类型的CDK/cyclin复合体,*包括D1-3，各亚型cyclin D在不同细胞中的表达量不同，但具有相同的功效。,活化 随Cyclin浓度变化而变化 激酶与磷酸酶的调节， 活化的MPF可使更多的MPF活化 功能：启动细胞从G2期进入M期的相关事件,周期蛋白,CDK1的调节与活化; CAK=CDK1-Activiting Kinase,Cdc2与细胞周期蛋白结合才具有激酶的活性，故名细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)。 Cdc2又被称为CDK1，可将特定蛋白磷酸化，促进细胞周期运行，又称作细胞周期引擎。 如将核纤层蛋白磷酸化导致核纤层解体、核膜消失； 将H1磷酸化导致染色体的凝缩等。 在动物中已知7种CDK。均含有一段相似的激酶结构域，这一区域有一段保守序列，即PSTAIRE，与周期蛋白的结合有关。,四、CDK激酶和CDK激酶抑制剂,控制细胞周期的蛋白质,CDK类蛋白激酶：这类蛋白激酶常以磷酸化的形式直接作用于细胞周期，包括DNA合成的启动和终止，染色体的凝集、运动和松懈，核膜、核仁的崩解和重新形成，核纤层的降解和重新聚合，纺缍体的形成和消失等。它们可根据作用的时期不同分为G1、G1/S、S期CDK，及M期CDK。 cyclin：是一类能与CDK结合，使CDK磷酸化和活化的蛋白。这类蛋白的活性是随细胞周期而进行周期性的变化。,CDK抑制因子（CDK inhibitor，CKI） 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子对细胞周期起负调控作用，目前发现的CKI分为两大家族： Ink4(Inhibitor of cdk 4)，如P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，特异性抑制cdk4cyclin D1、cdk6cyclin D1复合物。 Kip(Kinase inhibition protein)：包括P21cip1 (cyclin inhibition protein 1)、P27kip1(kinase inhibition protein 1)、P57kip2等，能抑制大多数CDK的激酶活性，P21cip1还能与DNA聚合酶的辅助因子PCNA（proliferating cell nuclear antigen）结合，直接抑制DNA的合成,五、细胞周期运转调控制,一）G2/M期转化与CDK1激酶的关键性调控作用 二）M期周期蛋白与分裂中期向分裂后期转化 三）G1/S期转化与G1期周期蛋白依赖性CDK激酶,CDK激酶对cell cycle起核心性的调控作用， 不同的cyclin结合不同的CDK，构成不同的CDK激酶 不同的CDK激酶在cell cycle不同时期表现出活性，对细胞周期进行不同的调节。,G1期，在生长因子的刺激下，cyclin D表达，并与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb磷酸化，Rb释放出转录因子E2F，促进许多基因的转录，如编码cyclinE、A和CDK1的基因。,1、G1期时MFP的激活,2、在G1-S期 cyclinE与CDK2结合，促进细胞通过G1/S限制点而进入S期。向细胞内注射Cyclin E的抗体能使细胞停滞于G1期，说明细胞进入S期需要CyclinE的参与。同样将CyclinA的抗体注射到细胞内，发现能抑制细胞的DNA合成，推测CyclinA是DNA复制所必需的,3、在G2-M期 cyclinA、cyclinB与CDK1结合，CDK1使底物蛋白磷酸化、如将组蛋白H1磷酸化导致染色体凝缩，核纤层蛋白磷酸化使核膜解体等下游细胞周期事件,cell cycle regulation,在中期当MPF活性达到最高时，通过一种未知的途径，激活后期蛋白复合体-APC，将遍在蛋白连接在cyclinB上，导致cyclinB被蛋白酶体（proteasome）降解，完成一个细胞周期,分裂期周期蛋白N端有一段序列与其降解有关，称破坏框(destruction box)。 泛素由76个氨基酸组成，高度保守。共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径。 26S蛋白酶体是一个大型的蛋白酶，可将泛素化的蛋白质分解成短肽。,Destruction Box in Cyclins,Anaphase Promoting Complex (APC), 调控纺锤体装配检验点,APC介导选择性降解的靶蛋白与Ubiquitin结合 (通过泛素依赖性途径降解) APC主要介导两类蛋白降解: Anaphase Inhibitors和Mitotic Cyclin. 前者维持姐妹染色单体粘连, 抑制后期启动；后者的降解意味着有丝分裂即将结束，即染色体开始去凝集，核膜重建。 Cdc20 和Mad2蛋白位于动粒上，在染色体结合有丝分裂纺锤体前将不能从动粒上释放，由于Mad2与Cdc20结合而抑制APC的活性。所以只有所有染色体都与纺锤体结合后，APC才有活性，才启动细胞向后期转换。,M期CDK的激活起始于分裂期cyclin的积累。 结合cyclin B的CDK1被Wee1将Thr14和Tyr15磷酸化而不具有活性，使CDK/cyclin不断积累。 在M期，Wee1的活性下降，CDC25使CDK去磷酸化，去除了CDK活化的障碍。 CDK的激活需要Thr161的磷酸化，它是在CDK激酶(CDK activating kinase CAK)的作用下完成的。,M期CDK的激活,CDK activating,DNA的复制是由起始复制点（origins of replication）开始的，起始复制点是一种自主复制序列，散布在染色体上。在整个细胞周期中，起始复制点上结合有复制起始点识别复合体（Origin recognition complex, Orc），其作用就象一个停泊点，供其它调节因子停靠。 Cdc6是其中的一个调节因子，在G1期CDC6含量瞬间提高，Cdc6结合在Orc上，在ATP供能下，促进6个亚单位构成的MCM复合体和其他一些蛋白结合到ORC上，形成前复制复合体（pre-replicative complex，pre-RC） DNA复制执照因子学说；MCM实际上就是DNA解旋酶。,DNA复制的控制,S-CDK触发pre-RC的启动，同时阻止了DNA再次进行复制，因为S-CDK将CDC6磷酸化，使其脱离ORC，磷酸化的CDC6随后被SCF参与的遍在蛋白化途径降解。从而保证了DNA的复制当且仅当一次,限制点在细胞周期中的作用,细胞要分裂，必须正确复制DNA和达到一定的体积，在获得足够物质支持分裂以前，细胞不可能进行分裂。细胞周期的运行，是在一系列称为检验点（check point）的严格检控下进行的，当DNA发生损伤，复制不完全或纺锤体形成不正常，周期将被阻断。,细胞周期的限制点有四个： G1/S检验点:在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点(restriction point)，控制细胞由静止状态的G1进入DNA合成期，相关的事件包括：DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？ S期检验点：DNA复制是否完成？ G2/M检验点：是决定细胞一分为二的控制点，相关的事件包括：DNA是否损伤？细胞体积是否足够大？ 中-后期检验点（纺锤体组装检验点）：任何一个着丝点没有正确连接到纺锤体上，都会抑制APC的活性，引起细胞周期中断。,Four checkpoints,ATM（ataxia telangiectasia-mutated gene）。 最早发现于毛细血管扩张性共济失调症患者，人类中大约有1%的人是ATM缺失的杂合子，表现出对电离辐射敏感和易患癌症。 ATM编码一个蛋白激酶，结合在损伤的DNA上，其信号通路有两条。 激活Chk1（checkpoint kinase）, 使CDC25的Ser216磷酸化失去活性，抑制M-CDK的活性，中断细胞周期。 激活Chk2，使P53被磷酸化而激活，然后P53作为转录因子，导致P21的表达，P21抑制G1-S期CDK的活性，中断细胞周期。,癌基因和抑癌基因主要的内在因素 外在因素：离子辐射、化学物质作用