论文：D-二聚体检测的方法及其临床应用.doc

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- + 全血胶乳法（SimpliRed/simplify） + + - - + ELISA 经典ELISA - - + + - 快速ELISA法（VIDAS D-D） + + + + - （一） 胶乳凝集法 1SimpliRed（Agen Diagnostics Limited，Australia）是目前应用最广泛，性能也得到公认的自身红细胞凝集D-D检测方法。采用分别针对D-D和纤细胞上表位的双抗体，当血中D-D水平升高时，抗原抗体结合的增多而导致红细胞凝集，2分钟内可以判断结果，为半定量的白体红细胞凝集试验。其优点是可在全血中检测，省去了离心制备血浆的麻烦。对VTE的敏感性和NPV分别为81%-89%和90%-94%。如果仅对近端DVT而言，SimpliRed的敏感性和NPV叫更高些，特异性和PPV分别为48%和67%仍不失为一种有价值的筛选高危的近端DVT的方法。 2Liatest定量试验 可在20分钟内完成。临界值为500ng/ml时，其对VTE的敏感性和NPV分别为35%和96%。如果仅对近端DVT而言，其NPV可达100%。 Liatest 与经典ELISA法有很好的相关性（r=0.98）。（二） 快速ELISA法 1VIDAS DD（Biomerieux，France）是一种定量全自动ELISA法，在VIDAS免疫分析仪上进行。它将两步的免疫夹心法与最后的荧光检测结合起来。利用现成的单剂量试剂和分析仪中储存的校准系统，对单份样本进行检测。现成试剂由包被了鼠抗D-D单抗的固相移液装置和一试剂条组成，后者包含了其他所需试剂：结合剂（碱性磷酸酶标记的鼠抗D-D单抗）、洗涤剂、样品稀释剂和底物。将200ul血浆吸入试剂条后，所有步骤由分析仪完成。除需将血样常规离心15分钟外，结果可在35分钟内得到。结果以纤维蛋白原等价单位表示，其检测上限为1000ug/1，下限为50ug/l，低于正常参考值下限（68-494ug/l）。对DVT的敏感性和NPV分别为96%99%和95%99%。VIDAS DD是目前研究最多的一种检测方法，敏感性很高，与经典ELISA法有很好的一致性，最有希望取代经典ELISA法而成为DVT诊断的首选筛选试验。 2Instant IA DD（Stago，AsniereFrance）定性方法，在多孔膜上进行，利用免疫滤过装置并采用两种互补单抗，也可对D-D进行半定量检测。当样本中D-D水平高于500ng/ml时，将有颜色显示，颜色的深浅与D-D水平成正比此时结果为阳性。低于300ng/ml时无颜色产生，为阴性。在300-500ng/ml 时，有一灰色带显现，结果为可疑。本试验可在10分钟内完成。敏感性和NPV分别为78%-84%和86%-90%，敏感性低于VIDASDD。因此，Instant IA DD的应用远不如VIDAS DD那样广泛，还需进一步的临床应用研究对其进行严格的评价。 3Nycocard D-dimer Nycomed本法在多孔薄膜上经免疫过滤后，由单抗偶朕金抗体，后者的结合剂所产牛的红色强度由Nycocard显示，强度与血浆中D-D水平（500-8000ng/ml）成比例，可定量检测。几分钟内即可完成。敏感性和NPv在不同报道中差别较大，并且厂商和实验室的结果存在较大的差异。可能的原因是被研究的人群不同，如门诊患者以及近端DVT患者的比例等。然而，无论如何解释，这种实验室之间结果的不可重复性不可避免将影响其临床应用。 （三） 方法学的局限性 上述各种快速D-D检测方法的优点是明显的，但遗憾的是各种方法也存在不同程度的缺点。对于基于胶乳凝集原理的快速检测方法来讲，敏感度低是其最大的缺点，且由于具结果判断以阴性和阳性表示，无法通过降低临界值水平束提高敏感件。但是作为排除诊断试验，保证100%的敏感性是全关重要的。研究表明，若不能保证100%的敏感性，将会带来偏差，并造成严重的后果：每降低2%的灵敏度，就会有1/1000的可疑PE患者死亡。另外由于结果需肉眼观察，不可避免地存在不同观察者之间的差异。这些都是临床医师和患者有所顾虑的问题。 对于快速ELISA检测方法而言，各种方法之间的标准化是一个难题。现已有多种快速ELISA法，每种又有多种商品化的试剂盒。这些试剂盒使用的抗体及其捕获的相应抗原不同标本稀释度、检测限度和孵育时间等也互不相同。在151例临床疑诊为PE的患者中，全面比较了4种ELISA检测方法，发现各种方法中位数的变异系数（CV）从3.5%到17%不等，但各种方法间的CV值却相当相近（15%-20%）。这种较差的重复性至少可以部分解释各种ELISA方法间较小的相关性（回归系数约为0.60）。再者，个同方法所得到参考值差别也相当大，各种ELISA 方法之间很难标准化。但从另方面考虑，由于各种方法识别血浆或全血中的不同成分，并且采用了不同的技术，其结果的异质性是在预料之中的。所以，现在人们已经认识到，与其要求一种不大可能实现的标准化，还不如对每种方法根据以下四点进行临床应用评估，评估后制订出各自的严格的临界值。必要时，可通过降低临界值而保证100%的敏感性。D-D检测方法的四步评估包括：检测方法所用的技术；与标准诊断方法作全面比较，确定新方法的严格临界值（采用Receiver Operating CharacteristicCurre，ROC曲线分析）以及相应的对确诊VTE的敏感性和特异性；“管理”实验，即D-D浓度低于临界值的患者，停服抗凝剂，随访三个月以观察其是否有迟后发病现象，由此判断新方法的真正诊断价值；比较新方法的价-效比。三、DD检测的临床意义D-D的生成反映机体凝血和纤溶系统的激活，在各种血栓形成性疾病以及牛理性高凝状态时均有升高。特别是对VTE高度敏感，在VTE的排除诊断中具有重要价值。另外，D-D在心血管疾病、DIC、恶性肿瘤等疾病叫，也有明显变化，足反映疾病的严重程度、发展变化、以及疗效和顶后的有用指标。（一） 伴随有D-D升高的疾病1深静脉血栓形成（DVT）2肺栓塞（PE）3弥散性血管内凝血（DIC）4心血管疾病：急性心肌梗死、不稳定性心绞痛、动脉粥样硬化、冠状动脉硬化、高血压等5恶性肿瘤：乳腺癌、卵巢癌、急性臼血病等6手术、创伤后7溶栓治疗后8脑血管疾病9严重感染、脓毒血症、坏疽等10绝经后激素替代治疗、先兆子痫、妊娠11其他 甲减、慢性肝病等（二）D-D检测的临床意义 1D-D检测用于排除DVT静脉造影是最早应用的诊断DVT的方法，现任仍是诊断DVT的金标准。但是静脉造影价格昂贵，且具有侵袭性，存在一定的风险性，临床医牛和患者都不太愿意采用。另外许多基法医疗单位也没有作静脉造影的设备。日前应用较多的是一些非侵袭性的诊断方法，如静脉加压超声（CUS）或：维扫描（DS）。非侵袭性方法比静脉造影伤害性小，也更为方便，但仍然比较昂贵，并且需要专门的技术人员操作。由于在非侵袭性方法诊断为阴性的患者中，约20%的患者在随访中发生VTE，所以进行连续的动态系列检测是必要的。但这不仅更增加了医疗费用，也增加厂患者的焦虑，因为他们无法在5天内得到明确的诊断结果。 由于D-D检测安全简单、快速、经济、敏感性高。尤其是大量研究已经证实了经典ELISA法对DVT的NPV可达100%，各种新型的快速D-D检测方法对DVT也高度敏感。表2总结了各种D-D检棚方法诊断可疑DVT的特性。可以看出，如果采用D-D在人群小大规模筛选和排除DVT，叮以极大地节省时间和经费。闲为只行当患者的D-D浓度高于临界值时，才有必要采用更特异的超声波检查。 表2 D-D检测诊断可疑DVT或PE的特点回顾性的研究发现，在巳确诊的82例DIC患者中，FDF和D-D联合的诊断效率最高，为95%；而D-D本身的诊断效率可达80%，与联合FDP的方法相比，其敏感性没有降低（均为91%），只是特异性有所下降（68%vs94%）。D-D的诊断效率远远高于PT或PPT、血小板计数、纤维蛋白原、TT等。因此，作者认为，联介D-D、FDP和抗凝血酶检测是诊断DIC的最好策略，因为D-D和FDP可以提供快速、特异的诊断，而抗凝血酶则有助于了解疾病的严重程度和预后，FDP因其快速，且比D-D便宜，可以用于诊断确立后的病情发展监测。 此外，D-D也可在一定程度上反映DIC的严重程度。DIC患者的D-D水平高于DIC前状态（pre - DIC）患者的水平，后者的水平高于正常人。 4D-D在心血管疾病的意义 D-D的升高与动脉粥样硬化的发生和严重程度有关，也可作为急性心肌梗死后复发的预测指标。 研究发现，在没有心血管疾病症状的患者中，有颈动脉损伤、且有高度血栓形成可能性患者的D-D明显高于没有颈动脉损伤的患者，也高于有颈动脉损伤，但血栓形成的可能性比较低的患者。同样，在有心血管疾病症状的患者，如高血压患者中，D-D水平的升高也与动脉粥样硬化的发生有关。并且发现，D-D水下的升高与血浆脂蛋白（a）水平成正比。多元回归分析显示，D-D和脂蛋白（a）都分别是动脉粥样硬化的独立影响因子。 另外，D-D检测在急性心肌梗死后预测是否复发也有重要价值。心肌梗死后，如果患者的D-D水平持续偏高，复发的可能性比较大。但此预测价值存在性别差异，只有在男性患者中才有意义，其原因尚未明了。 5D-D在恶性肿瘤中的意义 恶性肿瘤患者大多伴有凝血和纤溶的异常，血浆D-D往往升高，且与浸润密切相关。 在21例转移性肿瘤患者中，D-D的平均水平高达2mg/L，远远高于同年龄和性别的正常对照组的平均水平（0.2mg/L）。同时发现，升高的D-D水平与单核细胞表面结合的活化蛋白C（APC）高度相关，却与单核细胞组织因子（TF）的表达和凝血酶抗凝血酶复合物（TAT）不相关，而后两者的水平在所研究的肿瘤患者中并未明显升高。这一结果反映了在这些患者中，发生了局部的凝血酶和纤维蛋白生成，而不是全身的凝血和纤溶的激活。 6D-D对术后抗凝治疗的指导意义 研究表明，D-D水平可用以调整低相对分子质量肝素（LMWH）的用量，对234例创伤手术的患者进行了抗凝预防治疗。LMWH的基础用量是28501 U/d，如果在术后第4天，患者的D-D水平高于2mg/L，将LMWH的用量增加每天两次。在术后5-7天作彩色多普勒超声检查。结果发现，高危组（臀、股骨或膝关节置换术，n=102）的D-D水平明显高于十危组（膝关节的其它于术、胚骨、腓骨和足部手术，n=132）。术后第2天和第4天的D-D检测对确实存在血栓危险的患者（即手术第4天以后D-D水平仍高于2mg/L的患者）的敏感性和特异性分别为100%和72.8%。高危组的DVT发生率为3.9%，其中近端DVT的发牛率为1.96%；中危组有一例（0.8%）发生远端DVT。这一结果显示，D-D是监测术后凝血激活情况以及LMWH抗凝预防治疗的良好指标。7D-D在绝经后妇女激素替代治疗中的变化 绝经后妇女激素替代治疗（HRT）对凝血和纤溶系统的影响尚未定论。大多资料显示，HRT有增强纤溶活性的作用，D-D水平有所增高。 8其它引起D-D升高的因素 在脑血管意外、溶栓治疗后、严重感染、脓毒血症、坏疽、先兆子痫、甲状腺功能减低、慢性肝病、结节病等情况F，常有机体凝血和纤溶系统的激活，也可见D-D升高。因此，D-D对住院患者的特异性比门诊患者差，更适用于门诊患者的VTE筛选诊断。 另外，一些生理因素也可影响D-D水平，如年龄和妊娠等。老年人D-D水平有所升高，与年轻人相比有显著性差别。在30-39岁组，D-D对VTE的特异性为72%；而在80岁以上患者，特异性降至9%。另有两组研究显示在70岁以上患者，D-D对VTE的特异性仅为14.3%和8.I%。妊娠妇女D-D水平也升高，且双胎妊娠升高的更明显。因此，在分析D-D结果时，应考虑这些可能的影响因素。 10引起假阴性D-D的情况 由于D-D对VTE高度敏感，但特异性较差，人们把注意力主要集中在假阳性问题上。但是D-D检测也可能出现假阴性结果。既往血栓患者的D-D水平低于新近发牛血栓的患者水平，小血栓的D-D水平低于大血栓。因此，有一些时间校长的小血栓会出现亚临床表现或阴性的D-D结果。另外，D-D对远端血栓的敏感性低，如果患者的临床症状不明显，D-D也可能出现假阴性。四结语 迄今，D-D的最人临床意义是在排除诊断可疑VTE中的作用。D-D对VTE高度敏感，如果患者的D-D低于临界值水平，常可排除VTE。采用D-D作为叮疑VTE的首选筛选指标，可以排除约30%的可疑DVT和PE患者；如果再结合临床预测患病率的盾，可排除诊断约50%的患者。这样不仪人人提高了诊断效率，而且降低了诊断费用，也较血管造影等方法更安全、快速，更方便于医生和患者。此外，D-D在诊断DIC、预测动脉粥样硬化发生、心梗复发和术后血栓形成、恶性肿瘤早期转移中的作用也受到厂关注。相信随着方法学的不断进步和临床应用研究的进一步广泛深入，D-D检测的应用前景将会更加宽广。 将致春琢斌廊爪赶官胖纹胰