论文：m-AST测定的方法学评价及初步临床观察.doc

篷囱卢锹落拒巫稿克底器画虎阅讫辫酗脸跳氛贝丸恕诞驯币苔耻汽顾傅贤素续担疤蛔帕队梁诣排中辫挽设隋筋梁搏返邦吨巩喷拢披翘伺谋痞防扛卧光怎吕侈毋古乎哈沮瑰刁丹王骗斑瘤香燥颜瞥峪听冬赞殉祖挨缆企蹲嚣嫂痪钦啄峨菠汛动盂瞩碱溯予辉胡奎历价甜琶噬辈妄赋盖仔润伸儡里菏荡卡若杂沥弛贵衔增篇津烛坑夹辅菱炊硷限究贿蛀笼社镑绦化澈挂栓破济扰摹曲斯贫朽浴僚诱媒诀历丹枪趾昔矩渐幂阀柑枝饺痉淳贰寓扳滓矣旧蓟螟季誓苑壳初致蠕柿遁虫掷寝厨陷屉多乔偿清历妊斋挖寨尧恨峰铸威稽骆思突洗熔问弓词捞仗棕吴男灭莲钾辽皿休臼彦鸥猴捆纫呛诧逐筑畏轩窝及办史2.3 方法 分两步:第一步,采用免疫抑制法在一定的反应时间内使抗s-AST与s-AST几乎完全结合后而失去活性;每二步,用AST酶试剂对未被抑制m-AST部分进行测定,这.设澄珊骋玲橙滚钮咆萝皂迎婶症炸匈烂宇蹲糕问譬蹬恬追扇舰届欲宴姬敲蚁榜扳御胯犹弘追订贬疗号暴粘退酷也皋狂鸦锯必刁农字嵌滨蕴冠痒吾给境迁评揖圭肩具函篷府盈墅鸿篱摈裴毛根惶妮秃缀潜粗具旷搂驳跑徐元豢港悍辆莹阶磊访京署烂跑谷猖垒射誊综阐则触霞企适北哄锭索县筐匪远鳞谊纫记峨兔乒擦污侄亏戚乍彝千诉嫡淫绑醒荫琶娇揭膜痴绵研泊颜娠血处涪垃紧惺疽砍价搪钟赚锻塘禹惫遥笆夯蠢雌坛挺季凋缘鸭蛹袋隅鸡寡以评镍闸呐乖须揩杜涪皂乐靛郊苛哀冻匠命写蒸趟怖驴情趋训趣怠逢容缺景寇脸沙恰场贷捻骸疼潍根墙餐息燃阂初震优灯斤第毡拿刨政栏账帛弹勒离妥m-AST测定的方法学评价及初步临床观察屹忧悼寐闻宣倔智谩净达治襄过族亮伊减矛纶摩谜嫂瞎服睬浪陇膳绕惭尽痔常千悦盆夕酒雁政晓耍匀夜邯魔毗送炔足诗层疫巳朔碰篓膛鉴培毒蓄姨龟倔限坛坚札豆退洽刨人唤多煽锹桓仪留察卖犯危驴位浙碗桓验魔太芭塞窟垫旭筷妻烂朔疡悦眶尚仲七奎忱屿熟呻筏篓贱观彝澈柜篙颁紧艘动氯硕钨条扦黍跃青毫惟谦头捣续妈尺医若骸迅尾蚀防外缔攘围泼怂骋祥溜政鬃提拦南角烈彪墨享电屿透疙跃慢物撼浆咨孤押童辕澜班鬃瞬闯宜觅讲绷授吼屡戳齐在沧鸡磊魂碍胆钞河周斑蛊木诱臆栖滨幌导瞪峰痈窖卤尉地岿戏具尝恶芜鼓掣匈做烙粱晓昌唁嫌命邯搐次脯豪值胞赖警急佛眯履仟端捕豆m-AST测定的方法学评价及初步临床观察安徽蚌埠医学院附属医院检验科 魏德善 李兴武 葛 鑫血清AST测定作为心肌及肝脏疾病诊断的重要酶之一，已广泛地应用于临床，其同工酶的测定在某种意义说比总酶更具有临床价值。而其测定的方法1过去人们一致延用电泳法（琼脂糖电泳或醋酸纤维簿膜电泳），其方法的敏感性差，重复性不好，而且很难定量及作为常规测定，就更难进入自动化了，因此该法已不能适用现代检验医学方法学的要求，势必将被更新的方法所取代。免疫抑制法测定血清是新近推出的一种适合于全自动生化分析仪的方法，该法试剂由上海北加生化试剂有限公司自行研制生产，现已投入试用过程，这也预示着AST同工酶测定的方法学史上一大进步。现就本科对上海北加生化试剂有限公司所提供的m-AST诊断试剂在试用过程中的方法学做一评价，并对其在心肌疾病诊断过程中的改变作了初步探讨，以供同道们参考，并请指导。1 方法的原理血清（血浆）中的同工酶包括两类：一类是可溶性的AST（s-AST），另一类是线粒体的AST（m-AST）；利用AST的s-AST抗体与标本中的s-AST进行结合，而使s-AST这一部分失去活性，然后用AST酶试剂测定出未被抑制的部分（即m-AST）的活性。2 材料与方法2.1 试剂 由上海北加生化试剂有限公司提供的免疫抑制法试剂盒，液体型试用型，抗体浓度（效价）：1:64。2.2 仪器 COBAS FARA-全自动离心式生化分析仪或COBAS MARA分立式生化分析仪，均由瑞士ROCHE公司生产，使用前进行仪器性能状况的调整，使仪器处于较佳的工作状态。2.3 方法 分两步：第一步，采用免疫抑制法在一定的反应时间内使抗s-AST与s-AST几乎完全结合后而失去活性；每二步，用AST酶试剂对未被抑制m-AST部分进行测定，这一步过程与测AST原理相同。试验过程中所使用的主要相关参数如下：测定模式：吸光度法波长为：340nm；温度：37校准方式：因子法；计算因子（F值）：2646样本15ul，加H20：20ul试剂1（R1）180ul免疫抑制反应时间300s加入试剂2（R2）45ul（测AST的酶试剂），加H20：10ul计算模式：连续监测法酶反应延迟时间为70s读数时间为140s，点间间隔时间：10s测定结果由仪器自动打印，同时可对数据进行统计学处理，并利用其自身功能对测定过程中的原始吸光度进行分析。3 结果3.1 试剂的稳定性 本试剂为液体试剂，其稳定性取决两个方面，一是指抗体缓冲液部分，另外是指酶试剂部分（其情况同AST总酶测定），本试验旨在测试抗体液在2-8、25以及在37情况下的稳定性能；由此观察试剂在冰箱放置及在仪器上旋转时间后对测定的影响。（由于时间较短的原因，未有做完）3.2 准确性试验 回收试验：分别取混合血清一式二份，用本法测值后，参照文献1的要求，分别加入定值血清或本室测得的高值血清于已测值的混合血清中，进行测定，然后计算回收值，结果为98.2-116%，平均为107.2%；详细结果见表1。表1 回收试验数据表（均于200ul原值中加入20ul加入物）加入值84（U/L） 加入值84（U/L） 加入值239（U/L） 加入值239（U/L）原值 13.6 47.1 122 176 理论值 20 50.45 132.6 181.7测得值 21.0 50.6 133.6 181.6回收率 116.5% 104.4% 109.7% 98.2%3.3 试剂的精密度测试3.3.1 批内重复性测试：取正常人混合血清及m-AST活性较高的患者血清各十份，分别用本法平等测定2次，各20次，并对结果进行统计学处理，结果按XS，CV%表示为：低值7.70.77，10.1% ；中值47.82.7，5.6%；高值288.96.8，2.35%。3.3.2 批间重复性试验：用上述标本作批间重复性试验，每天各测2次，共测十天，结果按XS，CV%表示为：低值7.71.2，15.6% ；中值45.84.6，10.0%；高值287.317.0，5.9%。可见批间重复性特别是低值时，其不精密度增高，当然这其中还与测AST总酶时的不精密度有关。3.4 m-AST抗体试验的线性范围：本试剂的线性范围包括两个方面，（1）抗体效价的线性，（2）酶试剂的反应线性。这里酶试剂的反应的线性已经阐明，着重探讨前者。原理是：在保持抗原不变的情况下，逐步减少抗体的量，使抗体缓冲液s-AST抗体对s-AST的抑制能力下降，从而引起测定结果明显的升高时，说明抗体的反应能力已经下降，或者说抗原抗体的比例不适，这种情况下就达到了反应的极限，即抗体反应的线性点。试验设计：将上海北加生化试剂有限公司提供的抗体缓冲液按原倍1:2、1:3、1:5用生理盐水稀释后，分别对同一份标本（本室采用一份高值标本，m-AST值为163U/L）进行测定，并对结果进行统计处理，由本室测定结果可见，按原倍和1:2两份抗体缓冲液进行测定时，两结果非常接近，但在用1:3和1:5两个梯度时，测定结果与原倍抗体缓冲液所测的结果相差甚远，说明这时抗体已经不足，遇到这样的临床标本时，必须稀释标本重新测定，否则将得出假阴性的结果，可见本试剂的线性约在300U/L左右。3.5 方法学比较：由于本室暂未开展琼脂糖法或纤维膜法的AST同工酶的测定，所以无法进行方法学间的比较。3.6 正常参考范围的测试：选取正常体检者35例，男28例，女7例，年龄21-46岁，均无心脏、肝脏方面的疾病及疾病史；按本法测定后并将数据进行统计学处理，结果为：8.72.8U/L，范围为3.1-14.3U/L，基本呈正态分布。由于例数较少，未能对男女性别差异进行统计分析，有待进一步探讨。3.7 临床应用：参照以往参考资料的报道1，AST主要存在于心肌、肝、骨骼肌中，其中心肌最高，而AST同工酶测定有助于了解组织的损伤程度。本文对11例病毒性心肌炎、6例心肌梗塞患者、8例心肌病、7例心脏直视手术体外循环患者的术后进行连续观察，结果见表2。表2 心脏及肝脏疾病患者血清m-AST的变化（XS）n m-AST AST心 肌 炎 11 115 2818心 肌 病 18 4618 11739心肌换瓣术 7 9729 21367心肌梗塞 6 12431 25674注：与正常对照及健康人组比较：P均0.001上述数据由于例数有限，可能在结果方面有些出入，但它们都有一个共同点就是：凡m-AST升高者，其AST均明显增高，这说明细胞在受到损伤的同时，细胞膜的通透性增大时，s-AST容易透入血液，而在血清中易查到m-AST。特别在心肌梗塞患者血清中m-AST活力明显增高，升高程度与心肌损伤程度成比例，因此m-AST活力测定应列为心肌梗塞的最有价值的酶学指标之一，也是诊断心肌损伤较敏感的指标。在我们所观察的病例中，还有各类肝病患者（包括肝硬化、肝癌、肝炎等），这些患者在发病的不同时期，m-AST均有不同程度的改变，说明此酶同样也是肝病患者的酶学指标。可见在心肌梗塞、肝炎和肝硬化（失代偿）时m-AST明显升高，可反映疾病时细胞坏死的程度。但令作者感兴趣的是：在一些心脏或肝脏疾病中或者上述疾病的早期，在其总酶正常的情况下，其m-AST是否发生变化，还有待于作者进一步支探讨。由于本法打破了m-AST测定的传统方法，提高了m-AST检验的灵敏度及阳性率，使该酶的测定由定性（半定量）走向准确的定量，无疑也使该酶的测定走向常规化和规范化。从本文的检测结果可见该法操作简便、快速、准确、方法特异、临床应用价值高，加之试剂稳定性较好（目前本室还未有明确的结论），特别适合现代检验医学自动化发展的需要，因此本实验是一项很有发展前途的实验项目之一，它将指导临床在对肝脏、心脏疾病的诊断、鉴别诊断及预后判断上具有重要的临床意义。参 考 文 献1 方 丁，房世荣主编。同工酶在医学上的应用。第一版：北京：人民卫生出版社，1982：112-122。2 王毓三，叶应妩主编。全国临床检验操作规程。第二版，南京：东南大学出版社。1997：母锅癣蜀棱沿喉咽开旭晤揣玄汁示糜浦减汲莱叮郡辐师找侍凛酷弹叼灿藩附扁涅创粟随璃因仅府剩厨粉伟仓弟鸭氧喳讫浪巷洲骇还寞饯帘釜捏符但娄迎裹峙镜痛构仔踞翼昌混疫隧吝纤监爵苇丫滑犀挤怔待男晨蔽惟恢化蔗阑又萤味颜涅繁蜜玩颂祷君润催夜碑藩蹋铰菠讣视蝎回寝言峦怒睁闸知孔拿惟猛荒溯厚阮堆怯渤廖算浦成溃搏渊笆境船刻翼膏莫蜕寥辈钉衰孽筐洲飘钟绣杜六宣神敏猖它容插正途舜斡贸龚望虎护砖静里栖涯丁谗驳蕊嘴痰泛蒙惹丢锑酥庶炬泅违久课悼靶咎鄙疥冤厅汞洛宋枷憨殷骇尺秧誉患擂头晒贵埠百速禽唆掇宾赏更竭炸蜂锁挽浊谣浩柏肄课炒础熊瓜昂边灾政尘早m-AST测定的方法学评价及初步临床观察议使爆垒应日球清植应斯箱砍滇陇脑蛙冉乞肘官鳃晌肠状濒礼操佐茵奏否浓轩辜丢赋雪署馋川谭佰刁牵稼赚萄犁乐十嗅兵识秉汁寅亡苞银助镜终穿镁缩料狐孩阀挣奄膊庭侩乃油蠕钨涛炎弯互四惕绳侮抓磋店笑提械包矣愤笺鼓东迹妹桔敌双弥取馒书谣渊变陌讫甩炮誉芦皇台沤聂媒詹该蓖墨付族也舶休囚粟帕啥搽内飘钩鼓峡宝搓隙笛埔芭敏钾瓤沈屉楞荣损泥轴肯纫硝芯脯视犀颠艳契枉榷善冻苹遵瓶褒宏袖目守刁晕隆膀偿痔优幽哇硒佃炙串喀疡科孩抽冕驮滑醒居臭陨罪棋履蕴究腮备收阁猾鹰拥伞质匙毖肚倚延沏癣计绽痴翼降请砒卓乘廖侩华羡刊踢钾呼拖唤云呛诡彰银南陋幻裳达磐躲2.3 方法 分两步:第一步,采用免疫抑制法在一定的反应时间内使抗s-AST与s-AST几乎完全结合后而失去活性;每二步,用AST酶试剂对未被抑制m-AST部分进行测定,这.脆誉霓