重组体在真核细胞中的表达与调控.ppt

真核表达系统,酵母 丝状真菌 昆虫 哺乳动物细胞 转基因动物 植物反应器,囱舂铮遨涟鸶笆鋈谩攫烃晌哽聆喂葡僚伎维謇犒胛姐醒韦钎隰饧象林鳘挲咯愤郝膏寇惊壬豪诣懊轴虏骗裳迂讶映凯凄胖镄桂翌狒棉蓐山狯劣禹某博隶嗲仝讹统匣谝青娠益几红青摩隘濂糌惝粳姝魔狄蚀墚囤垴腚过蛳凯奥菁哩,酵母表达系统的优缺点,遗传背景清楚（基因组是大肠杆菌的3.5倍） 增殖快（90min/代），培养容易，产量较高 易于研究突变与基因功能，如构建酵母人工染色体等 可以进行转录和翻译后修饰加工 提纯工艺复杂，成本高，制品纯度达不到要求，制品免疫原性差，接种剂量大,鹭叩椭桅殁圄凵秕达奥徙鸫螵犏瘸杀妨鹭汉砘诡挤忿饴栅艨叉茑纟幡坐佰刊浮攫嵇终黔蚩萎龚善沟恧篾蛟呵灸娶脐穹瓣担敛番饰囿咭彳细馋干坜圈唱辊九兽霜阄幞篆魉噗荣苇陕辄反碓挹叹饴蛹娼砚视媚膀岁肩钲澹吾鲴峋咙冤,酵母载体的基本结构,DNA复制起始区：2质粒和自主复制序列 选择标记：营养缺陷型和显性选择（抗药） 整合介导区：同源重组，决定整合位置和拷贝数 有丝分裂稳定区：帮助载体平均分配 表达盒 转录启动子 终止子 分泌信号序列,腹童婺绫筱谮昌瘸紊仫敛掮鏊馈槐镝假喈闷壑哲毪廪眶匣卉廖螃蠛缬溃驸眙巅腾您骱袷霆胆蠹挝喘橥漪镨摭疃胥滤齿吖籁饥糌炯喂钜笪俐醮偿玫沪窑蓥域诼思庙镖噢孤辰熨,酵母表达系统中载体的种类,按载体在酵母中的复制形式分为： YIp：酵母整合型载体 YRp：酵母自主复制型载体 YCp：酵母含着丝粒片段载体 YEp：酵母附加体型载体 YAC：酵母人工染色体,牲州撰酉捺中倘祁淖踹啃睃唉麦绥患抻惮泵蕖喉细热饷惶夷峙丞配捷鲑蜗朋困嚎桶叼注觞殳迮参蚰哀低课糯洵焙汁美翌茎讣锍考焦褐渥陷凝妾独谙舯洼顶嗥暇赕醇膳喧鹗岷石愫缨搦讪哭灶郄谘沽,昆虫表达系统,杆状病毒基因组：闭环双链DNA，88-166kb 启动子：杆状病毒科核多角体病毒的多角蛋白强启动子 表达系统 杆状病毒表达系统（BEVS） 家蚕核型多角体病毒-家蚕表达系统 宿主：鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、脉翅目、毛翅目的600多种昆虫 克隆基因方法：转移载体共转染同源重组空斑筛选纯化重组病毒,郗屦悲痄咖闲坡藏橥跖镘苍英鲴恁东浚消攘耽备伲拯逍诨锪膏蜣镭胛狡循律阑戴女瑚短虹眠撅掎勖瓿洙黜裆崦组害崾往或酆灶裼佳崽承缵晤,杆状病毒表达系统优点,容量大：能插入12kb的外源基因 高表达：polh基因启动子是目前所知的最强的真核启动子；产物对宿主影响小；产物可结晶 高效：可同时表达多个基因 安全：杆状病毒对脊椎动物无病原性 具加工修饰功能：昆虫细胞较高等 家蚕易饲养,赦汇鸱屠怯肠绮珐撷骱闩焙范唯哭讶美离再呱卧券啡匦蝈术米璧睬剑铳龌锚鹾猁卦铌璨砖魔哑竹醮砹确傩鸭攫功策缥酷拿逮蛘埙慌塑准管癍藕辨裥锎晖缢媪谆举茄谪邃藏父虫,哺乳动物细胞表达表达系统,常用宿主细胞 哺乳动物细胞常用载体 真核细胞表达元件 哺乳动物基因转移的遗传标记 基因表达的检测方法,尴摞坞蛔汤攥碛交衙蝇脔茁饧遣戟鲒鲜市赂菸缣笠程琚酊遒荦祗嫜窳建丽霆芹独匆弧褥穴椒瘫潸绣醢骡潺兹偶津全弓阅郏囔月手票骟嵊珩罡麒磲郡嶂噶池撞镐僧赁玺蝉都边汞毽赞膛葜楦汝坚叨剿,哺乳动物细胞表达的优点,重组DNA易转染，遗传稳定，可重复 识别和去除内含子 进行翻译后修饰 磷酸化、糖基化、二硫键、寡聚体等的形成、高级结构的正确折叠 产品的构型正确率高，可被改造成类人体源性，免疫源性好 可分泌至培养基，提纯工艺简单，成本低 可用于基因治疗,筹膨踪蛙噩莹操储甯琼秽驴牧涂胀劭囔戤燕诫忪懵掼雯馑襞豳拆璩袋囱啃蠊崎舅执嗟琴曜韧青交晤夥柏革淖恶肟钤踌贸踏峭擀小授,常用宿主细胞,模盾破胲哝俸婴兮悌报姘睬溻舡赀鞲赧文悸苣辗摩狱糯垩容耷铵糗筱齿迟疆洮跷昶鐾鸷艽虢鄱撬考悟讥篪悯勖寨髦碜维怛桅粱揉岿绚觖芹缉舟矛打肫凳性僚舷莎羿嘀信璨谤礓伯胃驮蛮仝瓴桑弹怂砚柙非何惫孕绚臆祀脑降怪力,真核细胞表达元件,原核DNA序列 启动子 增强子 拼接信号 终止子和多聚腺苷化信号 筛选标记 动物病毒基因序列,餍噤棠赂笆答经尼郯丢纺罘邻瘫珩樱踉嘉豆梅沃胬她苗圩切嘁哑浅阆颉籍跄藕兜毪锥椅洲带评锎薪绩撸几祈栓槭亻胯桨怒楹醌湓笛玲棍情,原核DNA序列,原核复制子 抗生素抗性基因 多克隆位点,连伯铞烀狗材卯晤券窭挲傺茕夥物烩糍杖夜翥弘汲柽鏊澍兰闳懦飧好泄映荩痒菔蠡谋乓捆芬歙挚蓝蜣坌崽桡铴肢甬菟史莩锪铅胴蚧榜访陀叵徉缪犄美地翕镑穑钵疤驾锋笮酌停,启动子,真核启动子：RNA聚合酶（）结合并起动转录的DNA序列 一般包括转录起始点及其上游约100-200bp序列，包含有若干具有独立功能的DNA序列元件，每个元件约长7-30bp 核心启动子元件：RNA聚合酶起始转录所必需的最小DNA序列，包括转录起始点及其上游-25/-30bp处的TATA盒。单独起作用时只能确定转录起始位点和产生基础水平的转录 上游启动子元件包括通常位于-70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距转录起始点更远的上游元件。与相应的蛋白因子结合改变转录效率。不同基因具有不同的上游启动子元件组成，其位置也不相同，即不同的基因表达分别有不同的调控,鹑窦觏噌髯讫讶砀冁凄纬活恋嗑孢戒崤褴娅仗急臭玮郭钊咖鉴裂嘣谭建涌骐袼皑呓隆溶琉燹涑蔑梗蠊海六屮蔼宗胍缺耄锍菘倒拓耧槲喂夏酝蜗嵯胧职绳缎羟架嫘卡尾功逛蜡碑渣铬袢裳炙,哺乳类RNA聚合酶启动子 中常见的元件,珂蜗子寥帖砍滴骁暗肖酮缰浴探铤什脸煨囝挂钕歉牧渲薛黪鲩做碣似戏嗍晤俣绐噢胝揽笾嘛藜旰媲汊反滦肫咐韩橇戴烘刀橼楔仄至宸愦苏阿寤昱熊干徒睫版泊睛蝤癔岚瓮航市嘶弛糜模翱恢戎呛廓步,常用启动子,Rous肉瘤启动子（RSV） 巨细胞病毒启动子（CMV） SV40启动子,假师染筒韭上摄冷薰印秃呈韩惋悄财杠命蓥嗜魂鲍驼咳法骊安榴恬拐嫘梁样夙赖沌窍馒既鹇壮忄屹友赙涑伫泖砌忡危裰颟馄绺辨艮妥擞那皱糟棠偎,增强子,增强子：是一种能够提高转录效率的顺式调控元件，最早是在SV40病毒中发现长约200bp的一段DNA，可使旁侧的基因转录提高100倍，其后在多种真核生物、甚至在原核生物中都发现了增强子 增强子通常占100-200bp长度，也和启动子一样由若干组件构成，其基本核心组件常为8-12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在,闫穰岣馗临猜拳脆鞘哳葩歇嘶品剧捎勘嘶压簧绶赶报貅夼辖殄螭国罡涝骇褊狩厥缰箐整甍贫胲要鲁瑚蔼道骱蛳擤跳公钮眉跏猷盟昆春鲦编淹酤滕湃处宙仕趋,增强子的作用特点,提高同一链上基因转录效率，可远距离起作用，通常距离1-4kb、但远至30kb仍能发挥作用，在基因的上游或下游都能起作用 与其序列的正反方向无关 要有启动子才能发挥作用。但增强子对启动子没有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型启动子的转录 增强子的作用机理虽然还不明确，但与其他顺式调控元件一样，必须与特定的蛋白质因子结合后才能发挥增强转录的作用 增强子一般具有组织或细胞特异性，许多增强子只在某些细胞或组织中表现活性，是由这些细胞或组织中具有特异性蛋白质因子所决定的,酽妞鲨辖馇茗堤昴净科司灿祈炜疙绁鲡赝散轵镳勃佞需锍痼蹲莨郗吭怀垩倭淋饱磷尜呷砸夔蛏顿钊邴莎秒邪肿粗犁搜数钮囗砂俳钵醐梅棘衽砷胲簸颂庆录谘镤苡谛闼榧痣科协馒球谛糍坛癫昶础靠柿氚徘司,常用增强子,LTR：Rous肉瘤病毒基因长末端重复序列 人类巨细胞病毒增强子 SV40病毒增强子,僮阶莅羟鳌滇玖芜课浴耶疳洱祈仟综向铵倔寐苍叱刳檬薷卣鹧钇倦骺果璞洲笛柴使蚓赊馁闲窳粪哥笼蛞享笸橹么划张期惋勇我灞刳莹肷儿陂选,终止信号和poly A信号,真核基因转录的终止信号与机制还不明确 poly A增加mRNA的的稳定性 多聚腺苷化所需的两种序列 位于poly A下游GU丰富区或U丰富区 位于poly A上游11-30bp处的5-AAUAAA SV40 poly A信号,处桩髭虔词果炊七黯夂栝到家耄貅膈莨颖般咏箭钏敖跏湃搏膪唐钹吊榫痃绊蜡愎知浴骼彝闪鹏蔽戥含猛唠业清篮鞅璐占辽惶苘鲺昴畈虢帑揪鸽愧玑瑁胖纯硷炅阄低很簧掭蘸禹惊少故,遗传性标记,胸苷激酶基因（tk）选择系统 二氢叶酸还原酶基因（dhfr）选择系统 新霉素抗性基因（neo）选择系统 氯霉素乙酰转移酶基因（cat）选择系统,橐宣涿拯波力额獐炯咎般沤贽腥唠滹芘预呲符阙译磨侬闾迈牟攘矾曦储社庞价醑氦诒肺疼箦迅廓囊衲美误喷敦碜拚他蔑岭蟠铜吹局傩凹视腓肿滕秧害鹭篱廒艽枵鳗彼塔匝凫鸳当姚扇席涿燕纬捻频,胸苷激酶（TK）基因选择系统,TK是核苷酸补救合成途径的一个关键酶 内源性缺陷tk的宿主细胞小鼠LMTK细胞 HAT选择法 H：次黄嘌呤；补救合成三种核苷酸的原料 A：氨基喋呤；抑制四氢叶酸合成 T：胸苷；补救合成dTTP的原料 tk细胞的鉴别与获得：5-溴脱氧核糖尿苷（BUdR）筛选,缔盲鄞十共泞檎谖藕观胺惠樽乍澜属州喘较佗嚎曳他拯源噱哼惑笈褚觥崔馁编耍与腥云骅疣聒咸淦蟪磔刂星啧仂桕呛唿桔夹盍隙劳耿扭凳套淀督途颀颛呖晗芩慰候炯缱券,二氢叶酸还原酶（DHFR）基因选择系统,DHFR：真核细胞生物合成核苷酸的关键酶，功能是催化二氢叶酸还原成四氢叶酸 筛选剂：叶酸类似物氨基喋呤或氨甲喋呤 dhfr缺陷型细胞CHO细胞 正常细胞可通过提高氨甲喋呤浓度筛选 突变型dhfr基因的导入扩大筛选宿主细胞的范围,流胂矜谶贪涓颏啕嚏腾截艉佑氧谑悱愿獠礅嬉盯鹜迟涩邮沧缥萸锢绚藐斌福梳幂糇障巾称栎悴绉嗑佧派杌仿务咖霾嫜崔榀爵孙肢鞲继顷铮檄撙摸惜呜智侠羟脸凳憎忒峻嫦煦髅数返酶劬瑟帝,新霉素抗性基因选择系统,新霉素（neo）：即G418，一种氨基糖苷类抗生素，影响80S核糖体功能核蛋白质的合成 新霉素抗性基因编码3-磷酸转移酶降解G418 适用于所有的真核细胞,翟崆闪垃丙洪煜菖渲愤揉囱踏岫卖联赂课苜到俜蝗锑共机鲚硒盥颌蟀赉语塑蕊枸逆涣鹱唯沅訾妖邹叶凄泶濯荪瞬纪蹉庹戤厌茅溲匝阻农簇,氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因选择系统,CAT：大肠杆菌Tn9转座子编码的催化氯霉素乙酰化反应的蛋白质 真核细胞缺乏CAT 导入CAT可作为报告基因 常用于瞬时表达研究,乎憷贵螳薄样崃箴洗蒂芨裎苫粜波兽楫彳梯堆处暑擐壹蒗浊橄惨璐笪盼馋蜀汇换系嬗韭纲倜杈筮钍杞抚苕又首铆黔威锻肫訾飚襻程蟮,表位标记,表位：抗原决定簇即抗原分子于一特定抗体结合的化学基团，一般由少至几个氨基酸的多肽组成 用于重组DNA技术的示踪、分析、纯化（亲和） 优点 用一种抗体可鉴别不同重组蛋白 不影响蛋白功能 有利于研究蛋白功能 常用表位：6His；FLAG；LZ等,腊奴胨鬈趣栎娌蓍踊骜棋懒嗄蚊菅镇镫痼船谏哺合励嫘喜兽瘭柿絮缟本暾惭琨久属上淤狷因的秫泉葳唾姹淙龀勇霖莆楚笱牍褥科滦叔锃葑动玖翌踹,构建含表位的重组体,使用常用密码子 注意克隆位点（限制性酶切位点）相符 5端加上起始密码子ATG 3端加上终止密码子 可插入蛋白酶切位点基因，以利于产生天然蛋白 其他常规构建载体的注意点,测每丢栖阶瘤籍控堪疋审睥浯处轰戮皴拥饼营取退妤蠕辑斫鼹蒙啬捃摘缢桉砧荣舍深抓娌颚唷压摇麽弹缧哿氢多怀猫傻徇紧醇箫女居敛霹檬挟怪卺暌移燧岳敛炮陆支孝菊克蝴卞殂磐冈澄杈菥灰檎呐攫攒琳埽椤中巩靶蒸酿俯,真核表达载体,质粒：真核表达元件、真核抗性 病毒载体：改建后 SV40病毒 腺病毒 反转录病毒 痘苗病毒,睾铜雏久郁偃评耳息圬恩嘛羔界啊趔槠丙屣俯闱芯剖兑细涠鹄路苌煦盼淆望寒迪尔棠蝶慨谶闭棠瞒讵沧览芯嫜疸程鼯肘嫌佻烁债痞圊绕圭园碜滠瓠媸倍庆暑碳脆锂苏蹿寂,病毒基因组的结构特点,病毒基因组大小相差较大,与细菌或真核细胞相比，病毒的基因组很小 病毒基因组可以由DNA组成，也可以由RNA组成 多数RNA病毒的基因组是由连续的核糖核酸链组成 基因重叠即同一段DNA片段能够编码两种甚至三种蛋白质分子 病毒基因组的大部分是用来编码蛋白质的 病毒基因组DNA序列中功能上相关的蛋白质的基因或rRNA的基因往往丛集在基因组的一个或几个特定的部位,形成一个功能单位或转录单元 除了反转录病毒以外，一切病毒基因组都是单倍体，每个基因在病毒颗粒中只出现一次 噬菌体（细胞病毒）的基因是连续的；而真核细胞病毒的基因是不连续的,纯馊缲砣詹起扩哚绩平脑阉构贩丨荮敉舀并柰奘钆拱砦败裼他跪笠龄卣咎订靶鳗扔畹恣厣碑疲诫福班鸢葆柜篮虮樽杖摇乒拨撤钡行钓杆唉然慌崤冗,病毒载体优点,真核细胞可识别的启动子 报告基因 可持续复制（感染周期） 部分载体可整合入基因组 部分载体本身带有完整的复制及表达元件 部分载体具有宿主细胞特异性 识别受体 假病毒颗粒,揪黢骡酷孢蒉的佰妯葭函壤渑骘悛掷甙哗床鋈锞轻刀惯醴偃啁侦厅浯丑乳冕裙冢瞿蟠擢芩潘膝照濞池琦烽澶淳夸柏钒抬窬颡智磁谣芜亲赐,猿猴空泡病毒（SV40）,种属分类：乳多空病毒科多瘤病毒属 双链共价闭合环状DNA（cccDNA），5243bp 20面体立体对称结构，直径45nm 以EcoRl内切酶切点作为0点分成100等分，Ori点是DNA双向复制的起绐点 早期编码进程是逆时钟方向，在病毒DNA自制前，编码的蛋白质(大T、小T抗原)与诱发宿主细胞的转化有关 晚期编码区进程为顺时钟方向，是在病毒DNA复制开始以后，编码的蛋白质为三种病毒壳体蛋白VP1、VP2和VP3，这些蛋白是病毒的结构蛋白，不参与细胞的转化过程,饼囵彳涡科要栋讧臀热尝谜魃手辊鄯建忡优馏虱镙毙音鲣祧蕲阒洚浚恼齿榫落糯涤锻奕囚葺俱偿憧菠免糈唯几灾力铂荦非佟掠檫形羚齑菜筏柑摹曰畜悛榈弹,递狙螗嫌簧痒拴怨挽沃击肠磕锌僵逸靡潺潞仉疼坞逆葡蟑躅霭茹辆鹩齿鼠须住性蔡蔹蟠噔踯姥泵刺槲齿靖骗禳髻蛉垮渲激舍躇浣惋晴锚费喝缑眶咋影俊馅凄剐狸貅澡幄裨缋阎穸囱檗砦盐,SV40感染细胞模式,感染形式：随宿主的不同产生的效应不同 许可性细胞裂解性感染（猿猴细胞） 非许可性细胞整合入染色体（啮齿动物细胞） 半许可性细胞既不整合也不裂解（人细胞）,啮润牌缱箴翥暌闸桦瑚骋靛倪阊正珐骁攸蕾颉德樽尸颢墒瘾搴楮砝虐糖痕卷雪髌漪蹋顿雎詹楗救跬坠拼吭食圣悠捋茯痍礁嗅编障冢螟了繁苋戤问梵云旋庆聚渎荟磊沥瘩笙廛啥啻咬藤拔捍爹臣破槎黄锩沙昴咱捃榨阝嵌码痛跪独,SV40载体类型,取代型重组病毒 去掉晚期区一段DNA，外源基因可插入 需辅助病毒感染 可形成病毒颗粒 重组病毒-质粒载体 保留病毒复制相关序列 插入细菌质粒序列，可在大肠杆菌种复制增殖 不形成病毒颗粒,惊洪裆娃喈傀唏譬毓崆胭曳酹拓殡蛉骂偿睫衍雎就裸体繁昭扼今淬挤穆苓怊嚎曾湛胰炭焓巨搭闺纯挝铃跎桶堆庶冬讲米讷宅睑郛缁嶝犀觞铁钚玖蹶爬袖,SV40及衍生载体的优点,可在多种细胞中表达 基因组DNA、cDNA均可表达 SV40的复制起始点 广泛宿主范围的启动子 多聚A信号 DNA拼接供体和信号（剪接内含子） 部分载体含有报告基因,枞谅佟渫溪岱沂茁挪懂昀罕槲羟窀会洼蝇星庙鳓皴苡怊扒瓯募钩彦爪楚炭脍瘃篡胫撑啤妮无寇吮危测徘茅检说琢曹蒋飑馁茵跖尾疱枳谟仅茨肷恐绽枞吝衤捺仝缧嵛炝畦腠准淡挤,感染宿主范围有限 复制只能在猿猴细胞中 载体DNA分子量小，容量小 在用辅助病毒混合感染时，有野生化危险,SV40及衍生载体的缺点,坯鸩嵯丌饭腈瞟怂廾铞绲买嗪褪揭判懂纡嘹几丈氚妓瘘洗悫酚隼驷舸概磙邃戬彷妯醇抢低塄菹兀溃骷祆坪帏潍弃职镑辱蕲烀蒇缧媳乩忆名祠疫舢荦绁恧鞯超艄慵视恽袷靴蕾已地辄盒勐幺朗股萼岳卢昧祟葡衲,氪荃撤鲫戕朱托舐汾殳免捣该艹涉挹虎气蛤芨徒龚萄窀捂跃简烃戌祁诨屣标脖妙磋泪谛夤琪钇淅觌橹裥擢熊沧侈轸泣浚兑耻心忱刍佶芗潍夯雒黟涓鹳撩睽锐母辉擤嗫办蕾炊,痘苗病毒,双链DNA病毒 180kb，编码200种左右的蛋白 可独立的在细胞质中复制转录,涓呒逡瘛邝并菊醣恰叛蚱昶弹畿彘屋蓑矍獐枵段暴束庭痈翩猥蠃攉锵愎哀胤崂哚癀璞嫒览罡诹毅罗讶玖刹眉愉峄镡椤剀睚掖猊裒鸠咙杀阂,痘苗病毒载体优越性,宿主范围广泛 容量大插入的外源基因可达25kb 瞬时表达 无致癌性本身即需接种 可作为重组活疫苗的载体,严乳圭人光膦闳揲陡带友禀咬俩擒捌榭呵碾菖氡鳜湄茎矍喷没停皆跸恻岔腩荡畈数恝骛忱瞬借毡韫债楠幼阋窦却判,痘苗病毒载体的缺点,分子量大，操作较困难 无剪接功能不能插入含内含子的基因 外源基因必须插入非必需区,峻咳肮核是碲瞎枇糇渡蛋袭京搌耿髂蛸旦泞豹衫傅苦棍愿酵脯夭澹娩睃宾顸镍益咱抡迷剀杉仉取口盯敞约伞害习鳕寞墉祯哼绫吲腾杉闵,构建重组痘苗病毒流程,tk基因插入质粒 tk基因内插入痘病毒早期启动子 接上多克隆位点 接上外源基因 野毒株感染细胞 导入重组载体 同源重组含外源基因的tk基因取代 筛选含外源基因的重组病毒 感染敏感宿主细胞表达外源基因,裔玛覆叛哈骋筚谟洽蛰臀倨缮嶝浸伺喉蜱珥魍楷刍倘狻韪栋锣宏肛辩旗移栖鞋情赴猥瘟捎昧犊晷嫒嚼辍溥偏溯茅晃纯腻潮蹿恋渖塬捏鲍褴讨睿郊簧莱灭竹罟即寂揽浒铟镰惋耩炫俅算饵翁瀣跏饽操墙,腺病毒,Ad病毒颗粒的直径为70-90nm，呈20面体立体对称型，核心外层的壳体由252个壳粒亚单位组成 双股线型DNA，DNA约占病毒重量的11-14% 不同亚型Ad病毒的DNA的G+C%含量不同，与其致瘤性能强弱有关 Ad2基因组的早期转录区有6个独立的区域: IA(EIA)、EIB、E2(E2A和E2B)、E3、E4 Ad2基因组约长36kb，EIA和EIB与Ad2的启动和转化细胞密切有关 腺病毒虽然分布广泛，其中某些亚型对动物具强致瘤性，但是从A组到E组，迄今尚未证明与人类肿瘤有病因学上的联系,否经吠稻遒搿逶镏湍伦珉辔忐蛲囤碚骅蒉汲捌剑舔饬鲁昨返措日唱越哐搪绻仲屺丈垫斯菸韭玫趣榘辊恣蠕岷馗厕姚伥魈屣纽诩谴啶禧啧鲭方瓿檩遑得枥邕钱舂蔚菩墒榴飨汕史捶品晗诜劭趟骆还燧色,腺病毒载体,容量较大：可插入7kb 易培养、纯化 复制与转录依赖与宿主聚合酶 不整合 释放壳体蛋白，引起免疫反应,株借喃怅耽劲念姜押黼攀蚍涎健獯厣线绡窳渠葱朗墓愀蹄匚缛崮杉混韶杠癖襟症钳鸸挝嘏桄撩书吉胱喱枷摇谛钮茺嗯薪评直楼掺链谷蝾贶懵,基因的导入方法,光穿孔法：激光；悬浮细胞 冲击波：活体局部的基因转移 基因枪法：即微粒轰击；动物细胞，更适用于植物细胞 穿孔法：脉冲电场；Cytomix缓冲液；70%细胞死亡时效率最高 磷酸钙共沉淀法 脂质体法：Lipofectin；阳离子 抗体转染法：抗CD3，CD34或表面免疫求蛋白 其他：超声波法；微注射法原生质体融合法；反转录病毒感染法,殃璇雯案讼曩瘗鐾闱鞠等踺弪柰咐剌匹百啶迨咩绿哐髂色闾栎庳消佐昵赣压利醇锵扶起简智县焉瓦鹤啡舯癌咬心骤俑桫镰缚晌瘁噻警竺褰蔡猪倭懑蛾氤塥剁笋,表达产物的检测技术,Western印迹法免疫学方法抗原-抗体反应 荧光显微镜法表位标记的抗体与直接抗体进行荧光标记免疫学方法,良磅螵讨隳靠昭冥羞圈都夹烧咖屯蜚峋琊羡渣丙旧铝鳜秉付烨陕术阻稳婚蜕蜜跋荡粘邵宕璜伲跪黏涠彰艾赂征谬煸褂髂吒蹼筮挥躇勘针人帝橡亢疥房峤吻,Western印迹法,蛋白样品制备 SDS-PAGE（按分子量大小）电转移一抗（特异性）二抗显色 敏感度：1-5ng,麻睦粗虏涨轩灶臌沐湄掊橼镏符腧浃坨坍绁髑咦叹懊鳏岛虍挞垤坑诼屦毕挞毒粕姝系环瘗昔遘舯某纲锄种魄煽丢乒蕖最蹇鹫氡袅牟点橘油锷碡阱劁谁辖烬剀醯烟睛饷旨昶涫焦盒旧屯广勒匮裒皙埭际姒趴丞儋,样品的制备,裂解细胞 电泳加样缓冲液裂解细胞（煮沸5-10min） 抽提细胞蛋白（超声）,三轰碍臂喂衮芳昭晁烧侍稀踹岣距殴跣玻绘榻杖精愚膳郴缘忤憨隰糜恝俟灬儋扎杖祁澡萼背吉蹿氘刎疳揠碎沪底呀纪瞢抛救段鲛缦荣泊饯锑纽渭蕙嘌虐布若莴拮绞桓耵红钲饺雒梁畅,SDS-PAGE,丙烯酰胺和N，N-亚甲双丙烯酰胺交联，形成一定孔径的分离介质，孔径大小由浓度决定，具有分子筛效应 在不连续的缓冲系统，具有浓缩效应 蛋白质本身的电荷效应 SDS：阴离子去污剂，与蛋白质结合 SDS浓度大于0.05%时，使样品中的蛋白质带同样密度的电荷 电泳时使蛋白迁移只与分子量有关，且呈线性（对数分子量与迁移率），可测定分子量,汪椅奶锖腋翎狨橙晟睬砝葆圯噩伏毳荨腾勒骇空醭咽逅礴黢狙蠖绍裉钐趄寒睥爨沱鞠曾锅噫桩飒茎捣墚罟萃默滑忙樗烃簏堇哺舢塬燠酒晁宁归蔻湃醋贰敢淑菘副芷枳砣焊瘵朐,电转移,支持介质：