海藻糖生物转化生产新技术.docx

海藻糖生物转化生产新技术1研究背景1.1海藻糖的分子结构及理化性质海藻糖（Trehalose）是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键连结而成，分子内不存在游离的半缩羟基，是一种稳定的非还原性二糖。海藻糖有3种光学异构体，其中型和型在自然界中很少存在，而型是最常见的海藻糖。图a.海藻糖的分子结构（型）海藻糖无色无嗅，具很强的热稳定性、酸稳定性和化学稳定性，对蛋白质、核酸、细胞膜等活体成分有很强的稳定作用，在活体受到外界压力（如干燥、冻结、渗透压等）时有保护作用。1.2海藻糖的来源海藻糖广泛存在于植物（藻类）、细菌、真菌、酵母和无脊椎动物体内（昆虫）。1.3海藻糖的工业应用由于海藻糖具备稳定的细胞膜和蛋白质结构，海藻糖具有抗冷冻性、保湿性、耐高温性、干燥抗性、非还原性等良好的加工特性，加之外源性的海藻糖具有良好的非特异性保护作用，因此广泛应用于食品、医药、精细化工和化妆品等领域。海藻糖可作为冷冻食品的保护剂。使用淀粉的食品，易因淀粉的老化而变硬，出现松散、白浊等现象，工业上主要通过添加糖类抑制淀粉老化，而其中海藻糖防止淀粉老化的作用明显优于其他糖类。在有效的保护蛋白质分子的天然结构的同时，也保持了食品的质地和风味。目前已成功利用海藻糖干燥的食品有牛奶、咖啡、果汁、脱水蔬菜等。海藻糖甜度低，渗透压与蔗糖相当，具有抗龋齿功能，可在食品中代替蔗糖使用。作为保护牙齿食品的甜味剂广泛应用于各种糖果、口香糖、糕点、饮料、冰淇淋、巧克力等。海藻糖具有保护生物分子的独特功能，是生物分子的特效保护剂和组织细胞的稳定剂，为医用生物制品，如血液制品、酶、疫苗、病毒、激素、单克隆抗体、重组人体蛋白等的干燥保存、运输和使用带来极大的方便。英国剑桥Quadsant公司和WHO进行合作，利用海藻糖干燥脊髓灰质炎疫苗，解决从生产地到第三世界一些国家的长途运输中的冷冻问题，统计仅此一项即可节省数百万美元的冷冻系统费用。海藻糖也可应用于保健品产业。活菌制剂是当今保健品的开发热点，但活菌在人体肠道内的存活率难以保证。如果能将海藻糖作为干燥保护剂，制成具有较高活力的菌粉，再用只能在肠道溶解的材料包装，生产出口服肠溶胶囊，将会大大提高活菌制剂的生物效价。糖脂是最重要的一类生物表面活性剂，海藻糖酯酶具有良好的表面活性性能，可用于石油的三次开采、日化、纺织等工业。另外海藻糖基本上不被牙齿所带的微生物发酵，可作为保护性增香剂，其结晶形式可与粘结剂如羟乙基淀粉等一起用作糖衣材料。海藻糖具有保湿、防晒、防紫外线功效，所以可作为保湿剂、保护剂、紫外吸收剂等用于皮肤化妆品、洗面奶。还可作为甜味剂、改良剂用于唇膏、口腔清凉剂、口腔芳香剂等。1.4海藻糖的生产途径 海藻糖生产方法主要有合成法、发酵法、提取法、酶转化法以及基因工程法。海藻糖的化学合成法是在2,3,4,6-四乙酰基葡萄糖和3,4,6-三乙酰-1,2-脱水-D-葡萄糖之间产生环氧乙烷加成生成。发酵法主要步骤是通过采用诱变、细胞融合或基因重组等方法培育出高产海藻糖的菌株，采用优化培养基和适宜的条件发酵，再采用有效分离提取技术对发酵产物进行精制。目前可利用的微生物主要包括酵母、革兰氏阳性菌，特别是微球菌属。提取法主要是指微生物提取法，也可从植物中提取，但该方法成本太高，产率太低未见工业化应用。微生物提取法是以酵母、乳酸菌、霉菌及其它含海藻糖的微生物为提取源通过发酵优化等提取出海藻糖，以酵母为主。早期商品化的海藻糖是从酵母中提取的，该方法主要是培养酵母菌株到对数生长期，然后通过对培养条件的控制，使酵母细胞处于胁迫环境中(如营养饥饿、高温、高渗透压、干燥和冷冻等)，造成酵母菌体内海藻糖的含量显著增加，可达细胞十重的20，然后利用乙醇等有机溶剂从酵母菌中抽提纯化海藻糖。2000年，南宁中诺生物工程有限责任公司利用此酶系成功开发出酶法转化木薯淀粉生产海藻糖的工艺，使我国成为世界上第2个酶法工业化生产海藻糖的国家。短链糊精该工艺利用短链糊精，经MTSase和MTHase作用转化生产海藻糖。2002年，我国结晶海藻糖产量达到200 t，价格为79元kg，海藻糖在我国也开始应用于食品加工行业。各种方法特点比较见表。表1.海藻糖生产方法的比较方法应用实例特点合成法至今未实用化产率低、分离困难微生物发酵提取法日本味之素株式会社利用氨基酸生产菌已实现海藻糖工业化生产提取效率低，成本过高酶转化法磷酸化酶法1998年日本有过商业化报道需消耗高能物质且磷酸化酶不稳定双酶法1994年日本林原生化研究所（转化率可达80%）以直链淀粉为底物转化率高合成酶法1995年发明，是目前研究热点之一底物为麦芽糖反应时间过长，反应温度低基因工程法转基因植物法把合成海藻糖的基因引入果蔬植物中，使海藻糖在作物中自行积累含量低成本高基因工程菌将酶基因转入微生物宿主中高效表达并合成海藻糖，或构建基因工程菌高效表达海藻糖合成相关的酶，在体外将底物转化为海藻糖成本低高效合成法和提取法产率过低，且成本较高，无法进行工业化应用；而磷酸化酶法需消耗高能物质，加之磷酸化酶本身不稳定也不适用于工业生产。目前应用较多的是海藻糖合成酶一步反应法和双酶法。海藻糖合成酶法以麦芽糖为直接底物，工艺简单，转化率高，但反应时间过长，反应温度低（一般为20-30）。而双酶法以直链淀粉为底物，通过两种酶的反复反应最终形成海藻糖。工业上常用脱支酶进行淀粉初步水解为双酶法提供底物。现代工业生产中也常常使用基因工程法（特别是构建基因工程菌）与酶转化法结合。综合以上方法的特点，本实验选用基因工程菌与双酶法结合的方法2研究内容构建基因工程菌高效表达海藻糖合成相关的两种酶麦芽寡糖基海藻糖合成酶(Mahooligosyl trehalose synthase，MTSage，EC549915)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(Malt001igosyl trehalose trehalohyrolase，MTHase，EC321141)，其中MTSase作用于底物还原性末端产生,1，4糖苷键到-1，1糖苷键的分子内转糖基作用，形成中间产物麦芽寡糖基海藻糖；MTHase则专一地内切该中间产物中麦芽寡糖基与海藻糖相连的-1，4糖苷键，使之分解产生海藻糖和减少2个葡萄糖单位的新麦芽寡糖如此反复交替进行2种酶反应就可以将麦芽寡糖或直链淀粉转化成主要为海藻糖，以及少量葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖的产物。而配合脱支酶基因工程菌，三种酶共同作用可将可溶性淀粉最终转化为海藻糖。实验选取pHY300-PLK穿梭质粒为载体，先进行诱导型启动子的克隆，然后进行报告基因的克隆（X1，Y1，Z1），三种基因功能见下表；转入表达宿主中进行发酵试验，最终得到所需的海藻糖。表2.三种报告基因表达产物基因表达产物X1GlgXY1MTSaseZ1MTHase3实验进展3.1诱导型启动子的克隆3.