临床药理学实验.doc

临床药理学实验Experiments for Clinical Pharmacology山东大学药学院二00八年临床药理学实验编写人员(按姓氏笔画顺序)曲显俊 纪建波 张庆柱 郭秀丽焦 波 韩秀珍 程艳娜责任编写者: 曲显俊山东大学药学院临床药学实验室编二00八年编 写 说 明根据医学系临床药学 (7年制)专业设置的目的与培养方案，结合当前国内外各院校在该课程教学方面的实际情况和学生特点，我们在总结实验教学和科研工作的基础上，编写了临床药理学实验讲义。该讲义的内容基本以模拟临床常见病和多发病模型，并以理论教学中各章节常用典型药物对机体作用特点为依据，观察这些药物的作用规律及作用特点，强调学生自己动手实验的机会，有利于提高学生观察和分析问题的能力，为进入临床阶段的学习与实践活动打下基础。由于没有其他可供参考的蓝本，本教材所编写的实验内容主要参考了本所实验室教师长期的科研活动并结合其他发表研究论文，可能存在一些不足之处，希望教师和学生在使用过程中发现和提出意见，以利改进。 编者 二00八年目 录实验室基本规则实验一 临床药理学实验设计的基本方法 1 实验设计的三大基本原则2 科研工作的基本步骤3 论文的格式和基本写法实验二 抗癌药物引起血液系统毒性作用观察实验三 解热镇痛药物的作用及与氯丙嗪的降温作用特点比较观察实验四 维拉帕米抗心律失常作用实验五 苯妥英钠的抗癫痫作用及其血药浓度测定实验六 药物对小鼠肝药酶诱导剂对药物代谢的影响（巴比妥类）实验七 有机磷急性中毒家兔乙酰胆碱酯酶活性变化及阿托品和解磷定的解救作用实验八 哮喘动物模型的制作及治疗药物疗效观察实验九 双波长紫外分光光度法测定氨茶碱血药浓度实验十 庆大霉素对大鼠的肾毒性实验十一 体外培养细胞观察阿霉素对K562细胞的杀伤作用临床药理学实验室基本规则1. 实验前仔细阅读实验讲义，了解实验目的的要求和操作步骤，结合实验内容复习有关的药理学基本理论及生理、生化知识。2. 实验时要按照操作步骤进行，准确计算药物剂量，仔细观察，认真记录，节约药品，爱护实验器材和动物。如有器材损坏应报告教师。3. 实验室内要保持安静、整洁、药品使用后必须用原瓶塞盖好，共用药品和器材不得任意挪动，动物取走后笼门要及时关紧。4. 实验结束后，要认真讨论，分析实验结果，写出实验报告。最后各组轮流打扫实验室卫生，清点实验器材，关好水电门窗。实验一 临床药理学实验设计的基本方法 实验设计是科学研究工作不可缺少的一个组成部分，是科学工作成败的关键是对所研究问题预先提出的设想及详细的工作计划。一个完整而正确的实验设计有助于正确反映事物发展的内在规律性。一、实验设计的三大基本原则：重复、对照和随机。 重复原则与样本大小重复原则亦称重现性。由于个体差异或实验误差，仅根据一次实验或一个样本动物所得的结果，往往很难下结论。在适当范围内重复愈多，则愈可靠。重复除增加正确性和可靠性外，还可使我们了解变异情况。所以在进行药理实验设计时，首先碰到的问题就是：该用多少动物或多大的样本进行实验，才能保证结果正确性和重复原则。样本大小的估计原则，需根据下列因素考虑：(1)变异系数(RSD)大，样本应大;反之，变异系数小，需较小样本就可得到显著的差别。(2)可信限要求小，样本需增大;反之，可信限定得大，样本就可较小。(3)p值要求小，样本必须加大;反之，p值定得大，样本就可较小。下面提出两种确定方法: 1. 根据动物类别和疾病的种类确定重复例数。 在动物实验时，小动物(鼠、蛙)每组1040只，中等动物(兔、豚鼠)每组830只，大动物(犬、猫)每组520只 。 在临床研究时，难治病(癌症、狂犬病等)为510例。急重病(休克、心衰、流脑等)为3050例，一般病或慢性病为100500例。 2. 根据前人或过去研究或预试的结果确定重复例数。 例如过去某项肿瘤实验治疗，治疗组与对照组平均瘤重相差3g，合并标准差(Sc)为5g，显著性(t)检验表明无显著性差异。假如这次又要进行实验，治疗组与对照组动物平均肿瘤重量相差在3g的机率为99%，那么每组需用多少动物? = 即 t值因估计n约大于30，故可按自由度30查表，得p=0.99时的t值为2.75。代入上式 n= 每组至少需动物42只。 对照 对照是比较的基础，没有比较就没有鉴别，也就谈不上科学性。对照应符合“齐同可比”的原则，除了所研究的因素(药物)外，其它条件各组也应一律“齐同”。如动物的性别、周龄和体重等，也应基本一致，只有这样才能具备“可比性”。所以实验设计必须设立对照组。对照组的类型有以下三种：1. 阴性对照。 包括: (1) 空白对照:不给任何处理的正常动物作对照。 (2) 假处理对照:即除不用被研究的药物外，对照组的动物要经受同样的处理，如麻醉、手术、注射不含药物的溶媒等。这种对照的可比性好，较常用。(3) 安慰剂对照:临床上常用的一种阴性对照。 2. 阳性对照: (1) 标准品对照:即以典型药物或标准品作为对照，以便评定药物的作用强度。 (2) 阳性对照:以有国家批准文号的有效药作为对照，如果新药优于老药，并有显著意义，则可肯定新药的价值。 随机:随机可使每个个体在实验中有相同的机会随机分组或接受处理，避免有意或无意造成的偏差。它有完全随机法、区组随机法、拉丁方阵随机法和配对随机法等。其中较常用的区组随机法。它是将全部动物按性别、体重及其它条件，等分为若干个组。每组中动物的数目与拟划分的组数相等。然后给每个区组中的每只动物编号，利用随机数字表将它分配到各组。例: 有25只小鼠，雄性10只，雌性15只，用区组随机法将它们分成5个实验组，每组5只动物，如何分法? 见表4、5。 表4 区组随机法表动物编号1 2 3 4 56 7 8 9 1011 12 13 14 1516 17 18 19 2021 22 23 24 25性 别 体 重18 18 19 19 1920 20 20 21 2118 18 18 18 1919 19 20 21 2121 22 22 22 22随机数字97 81 26 03 8939 46 67 21 1798 10 39 33 1561 63 60 25 9289 41 58 91 63除 数5 4 3 2 15 4 3 2 15 4 3 2 15 4 3 2 15 4 3 2 1余 数2 1 2 1 14 2 1 1 13 2 3 1 1 1 3 3 1 14 1 1 1 1分配组别2 1 4 3 54 2 1 3 53 2 5 1 41 4 5 2 34 1 2 3 5 表5 结果表组 别 动 物 号第一组第二组第三组第四组第五组 2 8 14 16 22 1 7 12 19 23 4 9 11 20 24 3 6 15 17 21 5 10 13 18 25 注意: 1. 雌雄性小鼠均按体重分别由轻到重或由重到轻排列并按顺序编号。 2. 每个区组动物数与实验组数一致。 3. 区组数等于总动物数除以每个区组动物数。 4. 各区组最大除数与实验组数一致。5. 每个区组内动物体重和性别最好一致。二、科研工作的基本步骤：1. 明确目的: 根据课题要求确切了解实验要解决的主要问题，然后围绕中心问题设计实验，做到有的放矢。 2. 查阅文献: 查阅与课题有关的文献，了解国内外动态及先进的方法，吸取前人的经验，以利于课题设计。 3. 实验设计的主要内容: (1)题目:应简练、明确、客观。(2)引言:扼要阐明所要研究问题的现状及立题的目的和要解决的问题。 (3)材料:包括动物品种、规格、数量、来源；药品的规格、批号、来源及仪器设备的型号等。(4)方法:说明实验分组、实验步骤、操作方法，给药顺序、途径及药物剂量等。最好根据实验要求和观察指标拟划出结果记录表。4. 观察与记录 要全面仔细地作好原始记录，不要遣漏信息，更不要忽视例外情况。实验记录一般应包括:(1)实验样本的条件，如动物的种类、性别、体重等。(2)实验药物的条件。如药物来源、批号、剂型、浓度、剂量、给药途径。(3)实验环境条件，如温度、湿度等。(4)实验时间、方法步骤。(5)观测指标及实验数据，描记图等。(6)实验工作者的日程安排等。5. 数据处理:用图或表简明地将实验结果表达出来，并综合各组结果作出统计学结论和专业结论。 6. 撰写论文报告。三、论文的格式和写法 题目 作者及参加研究的人员和工作单位 摘要 引言 材料和方法 结果:经审查核对后，用统计学处理过的实验观察数据，不可把原始数据全端出来。 讨论:主要针对实验结果做出理论性分析。 结论:从实验观察的结果(感性认识的材料)抽象概括出来的一个判断(理性认识材料)，这个判断要回答原先建立的假说是否正确的，从而对该研究所提出的问题作出解答。 主要参考文献 完成论文日期实验二 抗癌药物引起血液系统毒性作用观察目的 掌握抗癌药物的主要毒性作用特点及作用靶点，学习外周血液细胞计数、骨髓涂片及观察方法。基本原理 目前临床应用的多数抗癌药物是通过抑制肿瘤细胞的生长而产生活性，尤其是细胞毒类抗癌药物，这些抗癌药物对肿瘤组织和正常组织的选择性较差，在抑制肿瘤细胞生长的同时，将对正常组织产生很强的毒副作用。主要包括对造血系统细胞增殖的抑制作用；对胃肠道及其他消化系统的毒性作用；对免疫系统功能的抑制作用等。其中对细胞分裂及生长迅速的骨髓造血系统等具有极敏感的抑制作用，首先表现在骨髓血小板系统、粒细胞系统、淋巴系统等受到抑制，并最终红细胞的生成受到抑制。检查进入外周血循环各系细胞数量，反应对骨髓造血系统的毒性作用，作为适时检测用药的依据。实验材料 观察药品：环磷酰胺器材：离心机，离心管，血细胞计数板，取血管，骨髓涂片用玻璃片, 吹风机。动物：昆明种小鼠。化学试剂：甲醇（固定细胞用）。实验方法 （1） 给药：将小鼠随机分为A和B两组，每组10只，A组腹腔注射环磷酰胺60mg/kg,B组腹腔注射生理盐水0.5ml,连续3天。（2） 计数外周血细胞：取小鼠，尾静脉或眼内呲取血20 l置于1980ul白细胞稀释液内(稀释100倍)，以玻璃棒或加样器取少许置血细胞计数板内，分别计数白细胞、红细胞和血小板数量，并与正常对照动物比较。（3） 骨髓悬液的制备、涂片、染色：处死动物，取股骨去净组织后，以1ml的注射器，抽取1-2ml血清或生理盐水，冲洗至离心管内。离心2000-3000rpm/m，3-5分钟，弃上清，将沉淀置玻璃片并涂片，快速干燥，甲醇固定，瑞士染色后，光学显微镜下观察并计数各系统细胞相对比例。（4） 观察与分类、计数。注意事项（1） 尾静脉或内呲取血量必须准确。（2） 骨髓涂片后要快速干燥，以防细胞形态皱缩。附录1.红细胞计数（red-cell counting）1.1.材料血红蛋白吸管、试管、血细胞计数盘及盖片、玻棒1.2.红细胞稀释液配制1.2.1.赫姆稀释液氯化钠 1g硫酸钠(Na2SO410H2O) 5g (或无水硫酸钠 Na2SO4 2.5g )氯化高汞 0.5g蒸馏水加至 200ml过滤备用。若血液中血浆球蛋白增高，使用该稀释液易发生红细胞凝集，可改用下列稀释液：1.2.2.氯化钠 0.6g枸橼酸钠 1.0g36中性甲醛 1.0ml蒸馏水加至 100ml过滤备用。1.3.方法1.3.1.取样 在试管内加入红细胞稀释液1980ul，然后用吸管准确吸取20l血液，擦净吸管外沾染的血液，将吸管插入试管底部，轻轻吹出血液，并用上清液吸洗吸管23次，将试管轻轻摇动12min，使血液与稀释液充分混匀。用洁净玻棒蘸取少量已混匀的红细胞悬液，一次滴入计数盘内，使之灌满，静置23min后计数。1.3.2.计数 先在低倍镜下扫视计数盘内红细胞分布是否均匀，然后把计数盘中央的大方格置于视野中。并将镜头换成高倍，计数5个中方格（共80个小方格）内红细胞数。压在线上的红细胞，只计数一个中方格四条线中的两条线。最后把所得总数10 000，即为1mm3（ml）血液中的红细胞总数。2.白细胞计数（leukocyte counting）2.1.材料血红蛋白吸管、小试管（0.60.8cm）、血细胞计数盘及盖片、玻棒2.2.白细胞稀释液冰醋酸 2.0ml1龙胆紫 1.0ml蒸馏水加至 100ml其中龙胆紫仅为显色用，以区别其他稀释液。2.3.方法2.3.1.取样 在试管内加入白细胞稀释液0.38ml，然后用吸管准确吸取20l血液，擦净吸管外沾染的血液，将吸管插入试管底部，轻轻吹出血液，并用上清液吸洗吸管23次，将试管轻轻摇动12min，使血液与稀释液充分混匀。用洁净玻棒蘸取少量已混匀的红细胞悬液，一次滴入计数盘内，使之灌满，静置23min后计数。2.3.2.计数 在低倍镜下计数内四角的四个大方格中所有白细胞数，最后把所得总数50，即为每mm3（ml）血液中的白细胞总数。3.血小板计数（platelet counting）3.1.材料血红蛋白吸管、小试管（0.60.8cm）、血细胞计数盘及盖片、玻棒3.2.血小板稀释液3.2.1尿素稀释液尿素 10g枸橼酸钠 0.5g40%甲醛 0.1ml蒸馏水加至 100ml过滤后4保存备用。3.2.2.草酸铵稀释液草酸铵 1.0g蒸馏水加至 100ml过滤后4保存备用。3.3.方法3.3.1.取样 在试管内加入血小板稀释液0.38ml，然后用吸管准确吸取20l血液，擦净吸管外沾染的血液，将吸管插入试管底部，轻轻吹出血液，并用上清液吸洗吸管23次，将试管轻轻摇动12min，使血液与稀释液充分混匀。静置35min，待红细胞溶解后再摇匀。用洁净玻棒蘸取少量已混匀的红细胞悬液，一次滴入计数盘内，将计数盘置于湿润的平皿内，15min后计数。3.3.2.计数 计数方法同红细胞，总数10 000，即为每mm3（ml）血液中血小板总数。细胞形态红细胞：圆盘形，两面略凹，无核。白细胞：圆形，有核。血小板：椭圆、圆形或不规则形，大小约为红细胞的1/51/3，无核。4.注意事项4.1.所用器皿要干净。4.2.血液与稀释液应充分混匀。4.3.计数室内细胞分布要均匀。4.4.细胞悬液滴入计数室内时，液量要适当，过多或过少都会影响计数结果。4.5.血小板计数时，摇动试管要轻，以减少血小板破坏，推荐使用草酸铵稀释液。骨髓涂片染色及方法用瑞氏吉姆萨（Wright-Giemsa）混合染色法1. Wright-Giemsa混合染色液配制Wright染液 5mlGiemsa原液 1ml双蒸水 6ml2.染色步骤涂片干燥后滴加Wright-Giemsa混合染色液，染510min后，自来水快速冲洗，晾干，镜检。细胞计数板使用方法:思考题：1. 常用抗癌药物的主要毒副作用有那些？2. 临床上主要在什么情况下可能通过观察骨髓涂片了解疾病的发病与病程进展？ （曲显俊）实验三 解热镇痛药物的作用及与氯丙嗪的降温作用特点比较观察实验目的 了解发热动物模型的制作过程，测定常用非甾体类解热镇痛药物的降温作用，比较其与氯丙嗪的降温作用不同点和作用机制。基本原理 体温调节中枢位于下丘脑，调控产热和散热过程，使体温维持在37C左右。在病理条件下，一些发热激活物，例如病原微生物（细菌、真菌和病毒）、非微生物抗原、炎症渗出物、致热性类固醇，刺激机体血单核细胞和组织巨噬细胞产生并释放内生致热源（细胞因子如白介素-1、肿瘤坏死因子、白介素-6等）。内生致热源再刺激下丘脑引起PGE合成和释放增加，作用于体温调节中枢，使体温升高。非甾体类解热镇痛药物通过抑制下丘脑合成环氧酶COX，阻断PGE的合成，能够使体温调节中枢的体温定点恢复正常。因此，该类药物只能降低发热者的体温，但不能降低至正常体温以下，而且不影响正常人的体温。吩噻嗪类药物氯丙嗪(chlorpromazine)也能降低体温，是通过抑制下丘脑体温调节中枢，使体温调节功能失灵。因次，该药可降低发热病人的体温，也可降低正常人体温，降温程度随环境温度升高而幅度变小，若配合物理降温，可降至正常体温以下。此外，降温作用与氯丙嗪的扩张血管有一定关系。临床常配合冰浴等物理降温方法，使体温降至28-32C，用于低温麻醉。配合哌替啶组成冬眠合剂，使患者处于深睡状态，体温、代谢和组织耗氧量均降低，称为人工冬眠。实验材料 器材：体温计(肛温表)，注射器动物：家兔6只药品：伤寒副伤寒菌苗，或10%蛋白栋或20%氯化钠（2ml/kg,iv），灭菌牛奶（2ml/kg,im）等。实验药物：安基比林，阿司匹林，氯丙嗪。实验方法取健康家兔6只，称重，编号，用肛温计测量正常体温。然后1，2，3号分别静脉注射伤寒副伤寒菌苗0.5-1ml/kg（或10%蛋白栋3ml/kg iv,40min后体温升高）。每隔30分钟测量体温一次。待体温升高0.6C以上时，1号与4号腹腔注射5%氨基比林溶液2ml/kg，2号与5号腹腔注射0.5%氯丙嗪溶液2ml/kg，3号与6号腹腔注射等容量生理盐水2ml/kg。给药后每隔30分钟测体温1次，共2-3次，比较其结果有何不同。注意事项（1）家兔应健康，雌性应无孕。（1） 家兔正常体温一般在38-39.5C，体温过高者对致热原反应不良。（2） 测温前使家兔安静，将肛温计甩至35C以下，头端涂以少量液体石蜡或凡士林，轻轻插入肛门内约3-4cm，扶住肛温计，3分钟后取出读数。（3） 本实验的致热原也可选用20%氯化钠（2ml/kg,iv），灭菌牛奶（2ml/kg,im）等。氯丙嗪降温作用特点取健康家兔3只，先测量正常体温及观察全身状态，然后甲兔静注0.7%氯丙嗪溶液1ml/kg，并用冰袋降温；乙兔静注同量氯丙嗪但不用冰袋降温；丙兔静注等容量生理盐水（1ml/kg），并用冰袋降温。给药后每20分钟测量体温一次，观察各兔体温变化及全身状态有何不同。注意事项 冰袋可置家兔腹股沟或腹部等处。思考题：1. 氨基比林和氯丙嗪对发热家兔和正常家兔体温的影响有何不同？为什么？2. 氯丙嗪的降温作用有何特点？有何临床意义？ （曲显俊）实验四 药物对不同类型心律失常作用观察实验目的 了解心律失常模型的制作方法，掌握利多卡因、阿托品抗心律失常的药理学作用及其原理，初步了解不同类型心律失常的心电图表现。实验原理 药理学研究中常用的心律失常模型有两类：过速型心律失常模型和缓慢型心律失常模型。过速型心律失常可以通过以下方法形成： 电刺激心脏诱导； 外科手术或器械损伤形成； 化学药物诱发形成。氯化钡能促进浦氏纤维钠离子内流，提高舒张期的除极速率从而诱发室性心律失常，表现为室性早博、二联律、三联律、室性心动过速、心室纤颤等；利多卡因等药物具有抗心律失常的作用，从而对抗氯化钡诱发的室性心律失常。缓慢型心律失常模型可由维拉帕米、麻醉剂和烟碱等诱发产生。维拉帕米能够抑制心肌细胞内的Ca2+内流，抑制窦房结的兴奋性，减慢心室的传导，阿托品对这种类型的心律失常具有预防和治疗作用。实验材料 实验器材：BL-410生物机能实验系统；大鼠解剖台，天平1台，大、小剪刀各1把，小镊子1把，注射器（5ml 1支，1ml3支，2ml 1支）。实验药品：3%戊巴比妥钠溶液0.4氯化钡2.5mg/ml维拉帕米0.5利多卡因1mg/ml阿托品生理盐水。实验动物：大鼠 实验方法过速型心律失常实验：1 选择230-250g健康大鼠3只，称重后编号为甲、乙、丙。腹腔注射3戊巴比妥钠1ml/kg，大鼠麻醉后，仰位固定于解剖台上，通过引导电极的连接方法形成大鼠的标准II导联信号引入连接，分别记录3只大鼠正常导心电图。2 分离股静脉，甲鼠静脉注射0.4ml生理盐水（对照），乙鼠静脉注射0.5利多卡因0.2ml/100g，丙鼠静脉注射阿托品1mg/只，分别记录3只大鼠给药后1、2分钟的心电图图形；然后，3只大鼠均静脉注射0.5氯化钡0.4ml/100g ，记录静脉注射开始第15、30秒钟和1、 3、 5、10、15分钟内的心电图变化，比较3只大鼠给予氯化钡后心电图有何不同。缓慢型心律失常实验：1 另取大鼠3只，称重，编号为1、2、3号。腹腔注射3戊巴比妥钠1ml/kg麻醉后，仰位固定于解剖台上，分别记录3只大鼠正常导心电图。2 分离股静脉，1号大鼠静注0.4ml生理盐水作为对照，2号鼠静注阿托品1mg/只，3号大鼠同法注射0.5利多卡因0.2ml/100g，分别记录3只大鼠给药后1、2分钟的心电图图形；接着，3只大鼠均静脉注射2.5mg/ml维拉帕米0.2ml/100g ，记录静注开始第15、30秒钟和1、 3、 5、10、15分钟的心电图变化，观察3只大鼠给予维拉帕米后心电图有何不同。实验结果 1 将实验结果填写记录表内动物数恢复窦性心律数心律失常持续时间（min）过速型生理盐水组利多卡因组阿托品组缓慢型生理盐水组利多卡因组阿托品组不能恢复窦性心律大鼠，心律失常持续时间按15分钟计2 剪贴有代表性的心电图，将各组给药前后的心电图粘贴在实验报告上进行分析。注意事项1 氯化钡需新鲜配制，快速注射，注入氯化钡的速度要求一致。2 利多卡因要缓慢注射。利多卡因作用时间维持时间短，因此预防给药组的大鼠注入数分钟后仍可能出现心律失常，此时可在注射利多卡因治疗，但不可过多。思考题1 氯化钡、维拉帕米致心律失常的作用机制是什么？2 利多卡因抗氯化钡所致心律失常的作用原理是什么？3 从本实验角度分析，心律失常患者临床用药应注意什么？ （杨月，郭秀丽，曲显俊）实验五 苯妥英钠的血药浓度测定及中毒反应观察实验目的 观察苯妥英钠的毒性反应，对药物血药浓度监测有初步的认识。实验原理 苯妥英钠治疗有效浓度为10-20mg/L，血药浓度大于20 mg/L出现眼球震颤，大于30 mg/L致共济失调等小脑前庭系统功能障碍，大于40 mg/L可引起精神改变。测定苯妥英钠可用光谱法、HPLC及免疫化学法，较成熟的是衍生化后紫外检测法。其原理是将标本调节至pH6.8后，以二氯甲烷提取及沉淀蛋白，再转溶于NaOH溶液，加KmnO4再加热，使苯妥英氧化为吸光值大的二苯酮衍生物，再以环已烷提取，247nm紫外光比色定量。本法灵敏度、线性范围、重复性均可满足TDM要求。实验材料器材 可调微量加样器 5ml注射器 具塞离心试管 水浴锅药品 20mg/ml苯妥英钠溶液 7mol/L氢氧化钠溶液 pH6.8磷酸盐缓冲液 3%戊巴比妥钠溶液 饱和KMnO4溶液 二氯甲烷 环己烷 动物 大鼠实验方法 1. 选择230-250g健康大鼠1只称重，腹腔注射苯妥英钠(120mg/kg),密切观察2小时内大鼠反应,并在给药后0、10、30、50、70、90、120min自颈静脉窦采血1ml，离心5min（2500rpm）取血清待测。2. 紫外法测血药浓度 取大鼠血清0.3ml，再分别加入pH6.8磷酸盐缓冲液0.3ml，混匀后用二氯甲烷5ml提取，离心15min（2500rpm），弃去上层，取下层二氯甲烷于另一具塞离心试管中，加入7mol/LNaOH3.0ml，混合均匀，离心15min（2500rpm），取上层碱液于另一10ml具塞离心试管中，置70水浴约5min除去二氯甲烷，加入饱和高锰酸钾溶液3.0ml，混匀，置80水浴加热20min，冷却至室温。加入环己烷3.0ml，混匀，离心15min（2500rpm），取上层，以环己烷为空白对照，在247nm波长处测其吸收度(A)。将吸光度值代入标准曲线方程，得到苯妥英纳的血药浓度。3标准液的配制 精密称定干燥至恒重的苯妥英钠标准品0.025g，加新沸过放冷的蒸馏水定容至25ml，作为标准品溶液备用。4标准曲线的制备 取10ml具塞离心试管6只，按顺序加入大鼠空白血清0.3ml和0、3、6、12、24、48l新配的标准品储备液，混匀，再分别加入pH6.8磷酸盐缓冲液0.3ml，混匀后用二氯甲烷5ml提取，离心15min（2500rpm），弃去上层，取下层二氯甲烷于另一具塞离心试管中，加入7mol/LNaOH3.0ml，混合均匀，离心15min（2500rpm），取上层碱液于另一10ml具塞离心试管中，置70水浴约5min除去二氯甲烷，加入饱和高锰酸钾溶液3ml，混匀，置80水浴加热20min，冷却至室温。加入环己烷3.0ml，混匀，离心15min（2500rpm），取上层，以环己烷为空白对照，在247nm波长处测其吸收度 (A)。以A对药物浓度C回归，求标准曲线方程。实验结果 观察大鼠中毒反应，绘制苯妥英钠血药浓度时间曲线 。 注意事项1 制备标准曲线时要操作规范，回归系数要达到0.999以上。2 实验中取上层氢氧化纳时应尽量少混入二氯化碳，70水浴时要防止二氯化碳沸腾时溅出氢氧化纳增大实验误差。3 二氯化碳应尽量除去完全，加入高锰酸钾氧化时具塞试管应密封，防止氧化产物二苯酮挥发，避免使测得值偏低。思考题1 仅凭血药浓度来反应苯妥英钠在体内的分布代谢是否合理，还应考虑哪些方面？2 苯妥英钠中毒时，如何抢救？ （杨月，郭秀丽，曲显俊）实验六 药物对小鼠肝药酶诱导剂对药物代谢的影响（巴比妥类）实验目的 观察巴比妥类药物对小鼠肝药酶诱导剂对药物代谢的影响。实验原理 巴比妥类药物（特别是苯巴比妥）能使肝脏药物代谢酶的活性增高，加速巴比妥类药物代谢破坏，因而长期应用巴比妥类药物可产生耐受性，效力逐渐减弱。实验材料 器材 1ml注射器 电子天平 小鼠笼。药品 5mg/ml Phenobarbitalum Natricum (0.5mg/ml 苯巴比妥钠) 2mg/ml Pentobarbitalum Natricum (0.2mg/ml 戊巴比妥钠) N.S (Normal saline, 生理盐水) 动物 雄性小白鼠(1822g左右) 实验方法 1. 取雄性小白鼠20只，称重后随机分为两组。甲组鼠腹腔注射5mg/ml Phenobarbitalum Natricum 0.2ml/10g (1mg/10g),每24小时注射1次，连续3次；乙组每隔24小时腹腔注射等容量的生理盐水，作为对照。2. 48小时后，给甲组和乙组小鼠分别由腹腔注射2mg/ml Pentobarbitalum Natricum 0.2ml/10g (0.4mg/10g),观察反正反射消失的时间并记录如下。结果记录表组别动物编号反正反射消失时间甲12345678910乙11121314151617181920 （纪建波，张庆柱）实验七 有机磷急性中毒家兔乙酰胆碱酯酶活性变化及阿托品和解磷定的解救作用实验目的 了解有机磷中毒的症状，观察阿托品和解磷定对有机磷中毒解救的效果及乙酰胆碱酯酶活性变化。实验原理 有机磷是剧毒农药,可抑制胆碱酯酶,使体内积聚大量的乙酰胆碱,导致M、N样症状;阿托品和解磷定可分别解除M样症状和恢复酶的活性,可达到解救目的。实验材料 器材： 恒温水浴 家兔固定箱 1ml、2ml、5ml、10ml注射器 10ml试管试管架 漏斗 滤纸 婴儿秤 5ml加样器 1ml加样器 200ul加样器 100ul加样器药品： 0.2% （V/V） DDV (敌敌畏) 1mg/ml Atropine sulfate solution (硫酸阿托品溶液) 25mg/ml Pyraloxime iodide (碘解磷定溶液, PAM-1) 500U/ml Heparin N.S solution (肝素生理盐水溶液) pH7.2 Phosphate buffer saline (磷酸盐缓冲液) 0.007M Ach substrate application solution (乙酰胆碱底物应用液)Alkaline hydroxylamine solution (碱性羟胺溶液) 33.3（V/V） Hydrochloric acid solution (盐酸溶液)10% Trichloride ferric solution （三氯化铁溶液）N.S (Normal saline, 生理盐水)动物： 家兔(2.5kg左右)实验方法 1. 取家兔2只,编号（甲、乙）称重,观察下列生理指标并分别纪录：活动情况、呼吸、瞳孔大小、唾液分泌、大小便、肌张力及有无震颤等。2. 将家兔分别固定于兔固定箱中，用500U/ml肝素（或10草酸钠）湿润过的注射器由耳缘静脉每兔抽血0.5ml ,作为用药前血样。然后各兔均由耳缘静脉注入0.2敌敌畏0.1ml/kg。密切注意上述各项生理指标的变化。3当中毒症状明显时，按前法每兔取血0.5ml，为农药中毒血样。继而立即给甲兔iv 1mg/ml Atropine sulfate solution 2ml/kg; 乙兔iv 25 mg/ml的PAM-1 ，剂量为2ml/kg。给药过程中和给药后密切观察各项生理指标的变化，注意各兔的区别和给药后好转的时间（观察结果填入表1）表1 家兔各项生理指标的变化兔号体重观察时间活动情况呼吸情况瞳孔大小唾液分泌大小便情况肌张力大小肌震颤程度给药后好转的时间甲给DDV前给DDV后给atropine后乙给DDV前给DDV后给PAM-1后4. 待中毒症状明显消失后20分钟，再以同样法取血0.5ml，为治疗后血样。5. 取上述三次待测血液样本，每一份血样都要分标准管、测定管和空白管，测定方法均按下表所示操作步骤进行。操作时，每加一种试剂均需充分摇匀，并严格控制保温时间。表 2 全 血 胆 碱 酯 酶 测 定 操 作 步 骤步 骤标 准 管（ml）测 定 管 (ml ) 空 白 管(ml )（1）pH7.2磷酸盐缓冲液1.01.01.0（2）全血0.10.10.1（3）37水 浴 预 热 3 分 钟（4）乙酰胆碱底物应用液1.0（5）37水 浴 保 温 20 分 钟（6）碱性羟胺溶液4.04.04.0（7）乙酰胆碱底物应用液1.0（8）室温静 置 2 分 钟（9）33.3（V/V）盐酸溶液2.02.02.0（10）10%三氯化铁溶液2.02.02.0 混匀2分钟后，分别过滤，于20分钟内，用酶标仪测定（选波长492nm），读取各管光密度。胆碱酯酶活力单位计算公式： 标准管光密度测定管光密度胆碱酯酶活力（单位/ml） 70 标准管光密度空白管光密度以1ml血液在规定条件下能分解1M乙酰胆碱的胆碱酯酶活力称为1个胆碱酯酶活力单位。式中“70”是由于每管中加有7M乙酰胆碱，0.1ml血液，即71.0/0.1=70注意事项 1.氯化乙酰胆碱在空气中易潮解，故需用具盖称量瓶尽快称好。2.水浴温度和保温时间都能影响酶的反应，因此必须严格控制。3.加三氯化铁溶液显色后，棕红色铁络合物易退色，故应在20分钟内比色完毕。如有大批样品需要分析，可分批加三氯化铁溶液。4若乙兔中毒症状严重，给PAM-1后应静脉注射阿托品1ml/kg。 讨论题 从阿托品和解磷定的解救效果分析二药抢救有机磷农药中毒的优缺点。【附】全血胆碱酯酶活力测定血中胆碱酯酶能催化乙酰胆碱水解为乙酸和胆碱。在一定条件（温度、pH、时间）下，乙酰胆碱水解的量和胆碱酯酶活力成正比。故在一定量的血液中加入一定量的乙酰胆碱，经过一定反应时间，测定剩余的乙酰胆碱，即可算出水解乙酰胆碱的量，从而推算出胆碱酯酶的活力。乙酰胆碱可与羟胺作用生成羟肟（wo）酸，后者在酸性条件下与Fe3+形成红棕色络合物羟肟酸铁，通过比色测定即可算出乙酰胆碱的含量。其反应式如下：（CH3)3N+-CH3CH2O-COCH3+NH2OH CH3CONHOH+(CH3)3N+CH2CH2OH Fe3+ （红棕色） 试剂配制（1）2/15M磷酸氢二钠溶液：称取Na2HPO4 23.87g，用蒸馏水溶解并稀释至500ml。（2） 2/15M磷酸二氢钾溶液：称取KH2PO4 9.08g, 用蒸馏水溶解并稀释至500ml。（3）pH7.2磷酸盐缓冲液：取2/15M Na2H PO4溶液72ml和2/15M KH2PO4溶液28ml混合即成。（4）0.001MpH4.5醋酸缓冲液：先用每升含冰醋酸5.78ml的水溶液28ml和每升含醋酸钠（不含结晶水）8.2g 的水溶液4.22ml混合成为0.1MpH4.5的醋酸盐缓冲液，再用蒸馏水稀释100倍。（5）0.007M乙酰胆碱底物用液：快速称取氯化乙酰胆碱0.127g(或溴化乙酰胆碱0.158g)，溶于0.001MpH4.5醋酸盐缓冲液10ml里，贮于冰箱中，临用时用pH7.2磷酸盐缓冲液稀释10倍即成。（6）碱性羟胺溶液：临用前20分钟取等量14NaOH溶液和14盐酸羟胺溶液混合即成。（7）10三氯化铁溶液：称取FeCl310g,用0.1N盐酸溶解使成100ml。（8）33.3（V/V）盐酸溶液：量取盐酸溶液33.3ml,加蒸馏水至100ml。（9）0.2% （V/V） 敌敌畏：取敌敌畏0.1ml加生理盐水至50ml。（纪建波，张庆柱）实验八 哮喘动物模型的制作及治疗药物疗效观察实验目的 了解动物哮喘模型的制作过程，测定常用支气管平喘药物的作用，掌握支气管哮喘发病机理及药物作用机制。基本原理 不少药物当以气雾法给予豚鼠时可以引起支气管痉挛、窒息，从而导致抽搐而跌倒。这种动物模型可用于观察药物的支气管平滑肌松弛作用。目前最常用的引喘药物是组胺和乙酰胆碱。药物气雾引喘装置见图实验材料 器材：药物气雾引喘装置动物：豚鼠4只药品：引喘药物，组胺和乙酰胆碱 实验药物，氨茶碱或特布他林实验方法取豚鼠6只备用。取豚鼠1只，放入玻璃罩内（容积约4L），以400mmHg的压力喷入2%氯化乙酰胆碱和0.1%磷酸组胺等容积的混合液15s，观察豚鼠的引喘潜伏期（从喷雾开始到哮喘发作、呼吸困难，直到抽搐跌倒的时间），一般不超过120s，超过此潜伏期可考虑不用。将选用的豚鼠随机分2组（据实验要求定），每组3只，实验组豚鼠腹腔注射氨茶碱125mg/kg(12.5%溶液1ml/kg)，或其他受试药物。注射后30min，重新测定其潜伏期，及6min内跌倒的只数。另一组以400mmHg的压力喷入0.5%异丙肾上腺素1min，让其再吸入3min，立即重新测定其引喘潜伏期，以及6min内跌倒的只数。注意事项（4） 气雾喷头所喷出的雾粒大小（其直径1-5m）是本实验成败的关键，也可用超声雾化器替代，但应准确定量。（5） 各鼠每天只能测定一次引喘潜伏期。同一天内，多次测定，会影响实验结果。（6） 判断药物有无平喘作用的指标：用药后引喘潜伏期明显延长；计算用药后6min内动物不会因呼吸困难、窒息而跌倒的只数，不跌倒者引喘潜伏期以360s计算。（7） 抗组胺药物无直接松弛支气管平滑肌作用，但用这种动物模