图位克隆的基本原理和方法.ppt

图位克隆的基本原理和方法,何宗顺 2011.12.7,图位克隆的基本原理,其基本的原理是： 功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，通过找到与目标性状紧密连锁的分子标记，在利用分子标记技术对目的基因精细定位的基础上，由于水稻全基因组序列的发布，我们可以得到已定位区段的候选基因，通过对候选基因进行分析，确定目标基因，最后经遗传转化试验证实目的基因功能。,图位克隆的步骤：,Primary mapping,Fine mapping,Candidate gene,Complementation test,Functional analysis,Primary mapping,primary mapping method and Mapping population,作图群体,将纯合突变体与ZS97进行杂交，对杂交的种子进行基因型鉴定，找到杂合型种子（即种子能够发生分离），将杂合F1代种子种下去后就能得到F2代群体。,R/R,r/r,R/R,R/r,F2,R/r,r/r,F1,P1 纯合突变体,P2 ZS97,primary mapping method,Bulked Segregment Analysis：群组分离分析法。原理是将分离群体(F2、BC1等)中的个体依据研究的目标性状(如抗病、感病)分成两组，每一组取样8-15份，在每一组群体中将各个体DNA等量（等浓度等体积）混合，形成两个DNA池(如抗病池和感病池)。同时需要构建两个亲本（ZH11/ZS97）的BSA池。由于分组时仅对目标性状进行选择，因此两个池间理论上就应主要在目标基因区段存在差异。,ZH11,ZS97,HL15(W),HL15(M),HY1(W),HY1(M),HY2(W),HY2(M),HY3(W),HY3(M),HY5(W),HY5(M),ZH11,ZS97,HL15(W),HL15(M),ZH11,ZS97,HL15(W),HL15(M),将构建的BSA池分别用本室的255对在亲本ZH11/ZS97间存在多态性的SSR标记进行PCR扩增，经过跑PAGE胶找到与目标性状紧密连锁的标记。,找到紧密连锁的分子标记之后我们就要进行一个“阳性”检测：即检测这个找到的分子标记是不是真正的与目标性状连锁。 我们对F2代群体中随机选取一个200左右的小群体，将找到的分子标记分别扩增这些样，看表型与基因型是否对应。 同时我们可以用这个小群体进行一个初步的基因定位。,Fine mapping,一. 表型观察 二. 筛选交换单株 三. 开发新的分子标记,R/R,r/r,R/R,R/r,F2,R/r,r/r,F1,P1 纯合突变体,P2 ZS97,正常表型,突变表型,ZH11：“A” ZS97：“B” 交换有两种带型：H和B,单株 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10,M1 M2 M3 M4 M5,H A A B H A A A A B,H A A B A A A A A A,A A A A A A A A A A,A H A A A B H H A A,A H H A A B B H B A,基因和表型相对应！,开发新的标记： 新的SSR标记： /modules/redbtools/ssrscan.php，运行SSRScan就会得到该段序列的简单重复序列。 InDel/Caps标记：将要开发标记的日本晴区段序列与93-11做一个blast，选取插入或者缺失比较大的位点设计引物。 SNPS标记:可以通过测序找到在ZH11/ZS97间存在单碱基差异的位点，或者找谢老师咨询。,Candidate gene,将最后精细定位区段在/cgi-bin/gbrowse/rice/ 中输入定位区间的物理位置，即可显示出候选基因。,精细定位,扩大群体，进行精细定位,找到候选基因后可对候选基因进行分析以排除非目标基因，可