大学生物学課件乙型肝炎疫苗课件

06乙型肝炎疫苗,一、概述,病毒性肝炎已成为 和艾滋病、肺结核、血吸虫病并列的危害最严重的四大传染病 在我国现有2000万慢性乙肝患者 在1992年曾做过肝炎流行调查，当时有1.2亿人携带乙肝病毒，丙肝在一般人群中感染率为3.1%,二、病理学,1. 临床表现 2. 发病机理 3. 临床诊断,1. 乙肝的临床表现,1) 急性肝炎 急性肝炎根据防床表现可分为黄疸型与无黄疸型 根据统计由乙型肝炎病毒引起的约占病毒性肝炎的40左右，急性乙肝成人较儿童多见。从病毒感染到发病有一个潜伏期，约30天至150天不等，潜伏期长短与感染剂量和途径有关。急性期一般2一12周此期由于转氨酶升高，血液中HBsAg阳性，可出现全身无力、食欲不振、恶心、厌油、腹涨、肝区痛等症状，同时部份人此时出现黄疸，黄疸维持23周。到恢复期黄疸渐消退，临床症状减轻以至消失，HBsAg消失，抗HBs抗体山现。亦有少数病例HBsAg持续存在甚至反复发作。 无黄疸型肝炎远较黄疸肝炎为多，该型除不出现黄疸外其他症状基本相似，但大部份人症状较轻，仍能保持一定的工作能力，肝脏损害也较轻，但多数病程较长，HBsAg常可查到。在发病后69个月约有50的仍有临床症状或反复发作可持续多年。,1. 乙肝的临床表现,2) 慢性肝炎 乙肝病毒感染急性期过后，病程超过6个月而肝脏炎症仍持续存在者， 包括：慢性活动性肝炎(CAH) 慢性持续性肝炎(CPH),1. 乙肝的临床表现,慢性活动性肝炎(CAH) 本病为肝脏进行性的炎症反应，在肝脏内有肝小叶结构破坏，不同程度的肝细胞坏死及纤维增生，血清内HBsAB及抗HBc阳性占90。男多于女，年龄多在20一30岁以上，24月龄婴儿亦有诊断为慢性肝炎者。 亚临床型病毒性活动性肝炎在临床上居多，HBsAg携带约有1020是CAH，而转氨酶正常的携带者中仅有2为CAH。1970年Mistilis氏报告80例慢活肝患者，经随访后治疗组存活率76，对照组为55，10年后治疗组存活率为58，对照组存活率为55。其死亡原因主要是肝功能衰竭胃肠道出血与败血症。,1. 乙肝的临床表现,慢性持续性肝炎(CPH) 肝脏基本结构完整，汇管区有炎症细胞浸润。病程长而不愈，保留有程度不同的症状，如疲劳、头晕、肝大、消化道不适等，少数有低热，一般情况尚好，肝功能轻度损害，超声波检查亦有轻度损害。 该病每因劳累、休息不好而加重。 病程可达数年。总趋势是逐渐好转，极少数恶化而变成肝硬化或发展成肝细胞癌。,1. 乙肝的临床表现,3) HBv慢性携带者 据Szmuncss报道，在美国有40万HBsAg带毒者而我国有一亿以上，部分人同时伴有慢性肝炎，另部人系无症状带毒者或称健康带毒者。在带毒者中有一部份人同时HBeAg 阳性。这些人又是重要的传染源。 关于慢性带毒者的转归，有40一60的人逐渐好转、HBsAg消失最终恢复；约有20一30的人转变成慢性肝炎甚至形成肝硬化，少数人可导致肝细胞癌。,2. 发病机理,乙肝病毒在肝细胞内的复制并不造成肝细胞的破坏，而肝细胞的损害主要是由免疫反应所引起，机体的抗体在清除病毒的同时，可引起肝细胞损伤。 肝细胞膜表面的病毒吸附位点可能成为靶抗原，病毒清除后肝损伤可以持续发展，在严重的肝损伤病例中，可以累积没有病毒感染的肝细胞，说明自身免疫反应在乙肝发病中有重要意义。关于乙肝病毒如何激发自身免疫的机理，目前了解仍然不多。,细胞介导的免疫反应,2. 发病机理,Dudleuy认为，T细胞的免疫作用与肝炎的发生有关； 肝特异性的自身免疫抗原即肝特异性脂蛋白(LSP)，存在肝细胞膜抗原（ LmAg ） 由于存在自身LSP和LmAg抗原,肝炎患者不断的产生抗体。又反过来作用于肝细胞造成肝细胞的破坏。,自身免疫反应,3.临床诊断,(1) 流行病学资料、如乙肝的接触史，输液史及应用血液制剂及药物注射史。 (2) 临床症状：如食欲减退、厌油、腹涨及消化道症状以及出现黄疽等。 (3) 物理诊断：肝脏检查是否有肝肿大及肝区疼痛，B型超声波检查出现异常， (4) 肝功能检查：如转氨酶测定早期急性肝炎均有转氨酶升高，慢性活动性肝炎也有转氨酶升高。抗LSP检查、麝香草酚、锌浊度及蛋白比例等项测定均能预示肝胆病变情况， (5) 乙肝特异性检查包括HBsAg、抗HBs、抗HBc、HBcAg和抗HBe即所谓两对半检查目前多用ELISA法、RPHA或RIA法亦可检查抗HBc-IgM及聚合酶、使用分子杂交及PCR技术检查乙肝DNA。,3.临床诊断,常规检查有肝功能，包括血清胆红素（T-BiI）、谷丙转氨酶（GPT）、乙肝表面抗原（HBsAg）等。 如果乙肝表面抗原为阳性，可进一步检查乙肝系列。它们分别为： （1）乙肝表面抗原（HBsAg）（2）乙肝表面抗体（抗-HBs） （3） e抗原（ HBeAg ） （4） e抗体（ 抗-HBe ） （5） 核心抗体（ 抗-HBc ） 。 个别病人需做特殊检查，可检查HBV-DNA，PCR，以确定有无病毒复制。慢性患者，须查甲胎球蛋白（AFP），以排除肝硬化及肝肿瘤。除做化验检查外，肝病患者还应该做B型超声检查。,3.临床诊断,乙型肝炎病毒前S1抗原PreS1有很高的特异性；其检测作为免疫清除乙型肝炎病毒，对抗病毒治疗、疾病预后以及弥补乙型肝炎e抗原变异带来误诊有积极作用。 现在诊断标准主要有如下五项： （1）血清乙肝表面抗原（+） （ 2）血清乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（+） （3）血清乙肝核心抗体IgM（+）或乙肝核心抗体IgG（+）； （4）肝内乙肝核心抗原（+）或乙肝表面抗原（+）或乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（+）； （5）乙型肝炎病毒前S1（+）或乙型肝炎病毒前S2（+）。,三、流行病学,流行情况 我国平均带毒率为8.7（用RPHA法）。分布不均。,三、流行病学,传染源及传播途径 1）传染源：HBV带毒者，黑猩猩也可携带HBsAg。传染作用取决于带毒状态： 孕妇HBsAg阳性，母婴传播在50 孕妇HBeAg阳性，母婴传播在80 抗HBe阳性，母婴传播在10 2）传播途径 母婴传播（垂直传播），占3040，怀孕期，围产期。 水平传播，6070，密切接触，血传播，医原性传播，性传播。,四、病原学,1. 乙肝病毒形态 2. HBV分子生物学 3. HBV的抗原组成,四、病原学,1. 乙肝病毒形态 1970年由Dane发现，分三类：,四、病原学,2. HBV分子生物学 DNA分子含有约3,200个核苷酸。它包括两个链；一个长度固定的负链和另一长度不定的正链。 短链的5-末端通过长达250-300个核苷酸的碱基配对而维持分子的环状结构。 DNA多聚酶作用不断延长短链3端以修补缺口。缺口可能与HBV的DNA在感染细胞内的整合有关。,四、病原学,2. HBV分子生物学 HBV DNA负链有四个开放区，分别称为S、C、P及X, 能编码全部已知的HBV蛋白质。 S编码主要表面蛋白和前蛋白（Pre S1和Pre S2蛋白）。 C编码HBeAg和HBcAg。 P最长，约占基因组75%以上，编码病毒体DNA多聚酶。 X区（核苷酸1,3741,835）可能编码有154个氨基酸的碱性多肽，长链的裂口位于此区。,四、病原学,3.HBV的抗原组成 1）HBsAg和抗HBs，前S蛋白 2）HBcAg和抗HBc 3）HBeAg和抗HBe 4）聚合酶和蛋白激酶,四、病原学,1）HBsAg 和抗HBs，前S蛋白 广义的HBsAg 由三种蛋白组成： （1）主要表面蛋白（S蛋白，小分子HBsAg） （2）中分子蛋白（中分子HBsAg）， （3）大分子蛋白（大分子HBsAg） HBsAg对一些促进变性的化合物、蛋白水解酶、酸性、碱性、冷冻融化很稳定，难以灭活。 表面的类脂质可能对于一些主要由蛋白组成的抗原决定簇起保护作用,四、病原学,1）HBsAg 和抗HBs，前S蛋白 S蛋白即狭义HBsAg， 是HBV囊膜的主要表面抗原的主要成份，包括糖基化的GP27和非糖基化的P24两种形式，以二硫键相连形成二聚体，代表HBsAg的结构单位，具备完整的抗原性。如二聚体解离，则HBsAg抗原性将会明显下降。 HBsAg 能刺激机体产生相应抗体抗HBS，它是HBV的中和抗体，具有免疫保护作用，HBsAg的检出是HBV感染的标志之一。,四、病原学,2）HBcAg和抗HBc HBcAg存在于Dane颗粒的核心和乙型肝炎患者的肝细胞核内。 是由包在DNA外面的核蛋白膜组成。 HBcAg一般从HBcAg阳性尸检肝或实验感染的黑猩猩肝脏提取。在乙型肝炎的急性期、恢复期和HBcAg携带者中常可测出抗HBc。此抗体对病毒无中和作用。体内如发现HBcAg或抗HBc表示HBV在肝内持续复制。抗HBc在体内可存在多年。,四、病原学,3）HBeAg和抗HBe e抗原的本质还不十分清楚，但多数认为它是潜藏存在于Dane颗粒的核心部分。到目前为止，尚未在HbsAg阴性的血清中出现过。 HBeAg是一种溶性抗原。 抗原已知有三种亚型：e1，e2及e3。由于HBeAg与DNA多聚酶在血液中的消长相符，故HBcAg的存在可作为体内有HBV复制及血清具有传染性的一种标记， 血中HBsAg滴度越高，HBeAg的检出率亦愈高。有些病人可出现HBe抗体，可能也是一种有保护作用的抗体。,四、病原学,4）聚合酶和蛋白激酶 HBV DNA 聚合酶(DNAP)：修补单股区域转化为相等长度的双股DNA，修补时从短股DNA的3端开始至5端。 HBV蛋白激酶：病毒核心和HBV感染的肝组织中均能发现蛋白激酶。使丝氨酸磷酸化，未见酪氨酸磷酸化，而致癌病毒使酪氨酸磷酸化。,五、疫苗制造及鉴定,1. 乙肝血源疫苗制造 2. 乙肝血源疫苗与鉴定 3. 基因工程乙肝疫苗制造 4. 基因工程乙肝疫苗鉴定,1.乙肝血源疫苗制备,(1)制备疫苗原材料 乙肝阳性血浆，鲜血人要求为健康带毒者，无严重疾病及传染病、过敏史等。无菌方式采血，并经外源病毒检查证明安全才可应用。,1.乙肝血源疫苗制备,(2)纯化 A粗提纯 首先将阳性血浆加钙脱纤，随之加入饱和硫酸铵，以盐析法去除血清中白蛋白 此步骤可去除60的蛋白质,1.乙肝血源疫苗制备,(2)纯化 B超离心提纯 制备之关键技术 HBsAg离心纯化过程通常先用等密度区带离心(溴化钾)而后用速率区带离心(蔗糖),1.乙肝血源疫苗制备,(2)纯化 C超过滤技术 大量制备乙肝抗原时，超离心技术是与超过滤技术配套使用的，每一步超离心之后必须用超过滤技术进行脱盐、脱糖并进行样品浓缩。,1.乙肝血源疫苗制备,(3) 灭活、除菌过滤及吸附 灭活 第一步：胃酶消化其目的是将纯化过程中尚存留的细菌和病毒进一步杀死，另一方面胃酶消化还有进一步去除杂蛋白的作用。但胃酶也去除了绝大部分Pres，通过胃酶消化蛋白总量较前减少14到l3。 第二步灭活用尿素处理，其浓度68mol/L，尿素可以打开蛋白分子氢键，从而使隐匿其问的细菌或病毒受到破坏，蛋白分子当去除尿素后又可复性。 第三步灭活用福尔马林(1：4000)，该步骤除灭活外，还有保护抗原的作用。,2.乙肝血源疫苗鉴定,(1)电镜检查 (2)HBv DNA聚合酶测定或HBvDNA分子杂交 (3)蛋白含量测定 (4)疫苗纯度测定 (5)小鼠ED50效力测定 (6)人群免疫效果测定,2.乙肝血源疫苗鉴定,(1)电镜检查 在蔗糖离心后取样滴在铜网上进行负染，放大60000倍观察。主要检查疫苗半成品以排除病毒颗粒。,2.乙肝血源疫苗鉴定,(2)HBv DNA聚合酶测定或HBvDNA分子杂交 DNA聚合酶活性测定，为测定是否有活性Dane颗粒存在，该法不够敏感，目前正在研究分子杂交方法，来检查DNA核酸片段，以确定是否有HBV感染性的存在。,2.乙肝血源疫苗鉴定,(3)蛋白含量测定 主要用Lowry法测定总蛋白，敏感性高，可靠性强，为国际上通用方法，测定范围在20一100之间。 特异蛋白HBsAg测定，即火箭电泳法，用不同浓度抗原作标准。结果与Lowry法结果相参考，误差不得超过10。 A1(OH)3的成品疫苗宜用TCA Lowry法该法所得结果一般高出Lowry法一倍。然后折算以确定HBsAg含量是否符合要求。,2.乙肝血源疫苗鉴定,(4)疫苗纯度测定 PAGE和SDS-PAGE法， PAGE法主要测出样品中是否含有分子量10万的杂蛋白，若存在则能进入分离胶，而HBsAg由于分子量大不能进入分离胶经染色即可确定。 SDS-PAGE法则为测定HBsAg之多肽成份，一般为23000及28000二条主带应占70以上。 两种方法均不应出现杂蛋白带。HBsAg的纯度必须90以上。,2.乙肝血源疫苗鉴定,(5)小鼠ED50效力测定 小鼠ED50为考核乙肝疫苗免疫力的重要指标之一，检定使用的小鼠为BALBC或NIH种。 参考苗由检定所统一供应，试验苗与参考苗的ED50倒数比值必须等于或l为合格。,2.乙肝血源疫苗鉴定,(6)人群免疫效果测定包括二方面内容 A：一般易感人群的免疫，主要为易感学龄前儿童或小学生，每批观察入数不少于20人，10ug剂量三针后抗HBs阳性率90合格。 B：母婴传播阻断观察，选用HBsAg和HBeAg双阳性孕妇新生儿，在出生24小时之内注射30ug疫苗，按0、1、6月三针后至1年，保护率70以上合格。,3.基因工程疫苗制备,酵母系统 哺乳动物系统 痘苗病毒载体系统,3.基因工程疫苗制备,(1) 酵母乙肝基因工程疫苗制备 首家乙肝酵母基因工程疫苗为美国Merck药厂生产于1986年底正式批准使用。其后施克(Smith K1ine)公司也正式投入使用。 其基因构建是用内切酶首先将HBv的s基因切出，前面加以甘油醛磷酸脱氢酶(GAPDH)作为启动子，后加ADH1作为终止物形成一个基因盒，与PBR322质粒重组，再与酵母的DNA复制起点构成穿梭质粒转化酵母细胞。这种重组体不能合成亮氨酸，可作为质粒存在的标志。表达量可达到5ug/ml，但不能分泌到胞外，须破碎细胞。,3.基因工程疫苗制备,(2)哺乳动物细胞表达的疫苗 将含有HBsAg基因片段，组建到含有SV40早期启动子的质粒中，转化细胞得到高表达的重组体，通过培养哺乳动物细胞使HBsAg被分泌到培养液中， 该系统的最大优点是使用传代细胞，可以每两天收一次，连续收获数次，如能克服污染则能得到较多抗原，对大规模生产有利,3.基因工程疫苗制备,(2)哺乳动物细胞表达的疫苗 该系统的纯化方法，一般先采用半饱和硫酸铵沉淀，然后用KBr超离心，超过滤后而经琉水柱层析或凝胶过柱，并进行除茵过滤加入Al(OH)3进行分装。这个系统建立细胞库十分重要。 这种方法表达的抗原大小亦为22nm，在SDS-PAGE上有23000和28000二条带，有时还有30000mw带，即所谓双糖化带。这种现象的免疫原性影响正在研究。,3.基因工程疫苗制备,(3)重组痘苗病毒疫苗 痘苗病毒是有185kb的大分子DNA病毒。能较容易插入含有HBsAg基因质粒重组构建成表达载体，通过痘苗病毒在鸡胚细胞中增殖，HBsAg可分泌到细胞外，其表达量约l2ugmL。 其生产流程为将鸡胚细胞与重组痘苗病毒混种，待病毒繁殖后收获培养液，超过滤浓缩，KBr和蔗糖离心，而后用胃酶消化及甲醛灭活，加入佐剂进行分装。 该系统表达的HBsAg与血源疫苗的完全一致，但该系统因用鸡胚细胞培养较一般工艺为繁，且表达量有待提高。,3.基因工程疫苗鉴定,重组基因工程疫苗大部分检定项目与血源疫苗检定项目是一致的，例如无菌试验，纯度检定，蛋白测定，效力测定，以及部分安全试验都是相同的； 仍有较多的不同之处（见下页）,3.基因工程疫苗鉴定,不同之处例如： (1)HBsAg基因表达产物的检定，HBsAg基因经克隆，并在细胞中重新表达，表达产物氨基酸序列是否有变异，因而需要分析N末端和c末端序列。 (2)用于生产的种子批毒种需要进行全面检定。 (3)细胞库的建立，存放于70以下的定量细胞，经一系列传代达到生产者选定的代数，用该细胞一个安瓶或多个安瓶，制成细胞库。供生产用细胞种子应无外源因子和遗传同源性，并得到检定当局批准。这主要适用于CHO细胞或其他传代细胞。 (4)DNA检定：根据WHO规定用传代细胞生产的产品，每个剂量的疫苗中传代细胞DNA必须在10 pg以下，同样对酵母细胞DNA及对痘苗病毒DNA亦要求在10 0pg以下。,六、疫苗应用,1.使用方法及注意事项 乙肝疫苗是由纯化的HBsAg小颗粒经Al(0H)3吸附制成的液体疫苗，有10ug和30ug二种剂量。本疫苗主要应用于婴幼儿，以及小学生，同时也用于与乙肝有密切接触的高危人群，如血友