实验五人淋巴细胞的培养.j.ppt

实验五 人类淋巴细胞株培养 培养基的配制,一、实验目的,熟练掌握RPMI 1640培养基的配制方法。,二、实验原理,细胞培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。,小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必需的生长因子；酶、微量元素和激素；保护作用；提供伸展和贴附因子等，是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质（重金属、抗菌素）的毒性。,小牛血清,氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养基提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20冰箱中保存，在使用前加入培养液内。,L-谷氨酰胺,三、仪器、材料和试剂,超净工作台 高压灭菌锅 多重蒸馏水器 磁力搅拌器 天平 微量加样器,（一）仪器,（二）用具、材料,细胞培养瓶 量筒、研钵、烧杯、漏斗、滤纸 pH试纸 微孔过滤器（0.22m）及注射器 各种规格的Tip 、离心管,（三）试剂,NaOH、 酚红 RPMI 1640干粉 小牛血清、青霉素、链霉素 NaHCO3 、L-谷氨酰胺 三蒸水,要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求： 一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。 二是严格控制无菌条件。,注意,四、实验步骤,（一）准备(清洗与灭菌） （二）合成培养基的配制 1. 1%酚红： 配制 0.1 mol/L NaOH 100ml。 称量 1g 酚红于研钵中，取 30 ml 0.1 mol/L NaOH逐渐加入研钵中，尽量研细，然后过滤。 过滤后的酚红液加三蒸水至 100 ml。 4保存。,2. 饱和NaHCO3的配制：,称取 10g 的 NaHCO3 溶于 200 ml 三蒸水中，灭菌后分装于50 ml 试剂瓶。 4保存。,3RPMI 1640 培养液配制：,配制50ml RPMI 1640培养液： 每组称取 RPMI 1640干粉 0.52g，溶于50 ml 的三蒸水。 置于搅拌器上搅拌 20 min，直到液体变为澄清为止。,磁珠,4. RPMI 1640 合成培养基配制：,加入 0.1ml 1%的酚红，通入CO2，使液体变为金黄色，说明培养基完全溶好。 配制好的培养基，用时用饱和 NaHCO3液调节 pH 至 6.8-7.0。 溶好以后的培养液在超净台中进行0.22m滤过除菌，分装至细胞培养瓶中。 瓶口封好，-20或4 贮存。,（三）小牛血清的处理,新买的新生小牛血清一定要灭活。 将买来的新生小牛血清不开封置于水浴锅中56，30min，期间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。 处理后的血清贮存于4。,（四）生长培养基的配制,1双抗： （100000U/ml） 160万单位青霉素/瓶+8ml 3DW = 20万单位/ml 1g链霉素+5ml 3DW = 200000 g /ml 各取以上的液体5ml混合，使其浓度为10万单位/ml，0.22m 过滤至1.5ml离心管，-20贮存。,2谷氨酰胺储备液（200mmol/L）：,1.5g的谷氨酰胺溶于50ml三蒸水中 （30 mg/ml= 200 mmol/L),0.22m过滤至1.5ml离心管中。 -20贮存。,3. RPMI 1