OD260与OD280比值的问题.doc

DNA纯度的判断根据OD260/OD280的比值判断，符合要求纯度高的纯化DNA其OD260/OD280在1.6-1.8之间，低于此范围表明蛋白质含量超标，高于此范围表明样品中含有RNA。一般机器给出的比值是分子分母同时减OD320所得,你可以自己算一下OD260/OD280,如果在要求的范围内,说明你的OD320偏高,即可能有有机物污染,比如酒精未充分挥发我要纠正一下，纯DNA的A260/A280应大于1.8，纯的RNA应达到2.0，样品中如果含有蛋白质及苯酚，A260/A280比值会明显下降。对于纯的样品，只要读出260nm的A值即可以算出含量。通常以A值为1相当于50微克/ml双螺旋DNA，或者40微克/ml单链DNA（RNA），或者20微克/ml寡核苷酸计算。OD260OD280 1.9-2.0 RNA居多 纯度已经很高了纯DNA：OD260/OD2801.8(1.9,表明有RNA污染；1.6，表明有蛋白质、酚等污染）纯RNA：1.7 OD260/OD2802.0（1.7时表明有蛋白质或酚污染；2.0时表明可能有异硫氰酸残存）OD是optical density（光密度）的缩写， OD1og（1trans），其中trans为检测物的透光值。 吸光度 吸光度,absorbance,是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度 与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数，影响它的因素有溶剂、浓度、温度等等 吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关。只要光的波长被固定下来，同一种物质，吸光系数就不变。 当一束光通过一个吸光物质（通常为溶液）时，溶质吸收了光能，光的强度减弱。吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。吸光度用A表示， Aabc，其中a为吸光系数，单位L/(gcm),b为液层厚度（通常为比色皿的厚度），单位cm ，c为溶液浓度，单位g/L 影响吸光度的因数是b和c。a是与溶质有关的一个常量，温度通过影响c，而影响A。一般来说OD260代表核酸的吸光度,OD280代表蛋白质的吸光度,OD230代表其他杂质(多糖等)的吸光度。 A260/A280与OD260/OD280的意思是一样的。A代表吸光值，而OD是光密度值，一个意思。A260/280比值一度成为判断核酸纯度的唯一通用标准，纯的DNA一般在1.8-2.0之间；后来发现在抽提过程中使用的许多试剂影响 A260 和 A280 读数；同时，对同一样品 10 倍数量级稀释后测定吸光值发现，分光光度计的吸光值仅在一定的区域是线性的。结论是：当 A260 读数处在 0.1-0.5 之间，A200 到 A320 之间的数值构成一条光滑的曲线时，少量苯酚 (30 ul/ml) 残留使 A230，A260，A280 均变大 (差不多增加一倍)，但 A260/A280 和 A260/A230 均在 2 左右。少量异硫氰酸胍 (132 uM) 残留使 A230 变大，但 A260，A280 几乎不变，所以 A260/A280 仍在 2 左右，而 A260/A230 大大低于 2。大量异硫氰酸胍 (2.4 M) 残留使 A230，A260，A280 均变大，根本就没有办法测定了。PEG (6.25%) 残留使 A230，A260，A280 均变大，但对 A230，A260 影响更大，所以 A260/A280 比 2 大不少，而 A260/A230 仍在 2 左右。核酸抽提中常用的试剂，如 Phenol，Guanidine Isothiocyanate，PEG 都能使 A260 和A280 的值变大，但是却可能使二者的比值与高纯度核酸的比值一致。因为 A260 值几乎是峰值，所以有必要在其两边各取一个：A280 和 A230。干净的核酸 A260/A230 应该在 2 左右。如果有在230nm处的强吸收提示污染有酚盐离子等有机化合物1.蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。2.苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。3.多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。因此，从这类材料中提取RNA时，需要注意多糖、多酚杂质的去除。4.设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD值时，对照及样品稀释液请使用10mM Tris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。比值低可能有蛋白污染，高了可能有DNA污染，建议你抽提的RNA分三管，两管保存，另一管