实验四麦清蛋白的初步提取实验报告.docx

生物化学实验报告实验四 麦清蛋白的初步提取一、研究背景及目的无论是在科学研究还是商业化产品的开发中，生物大分子的分离纯化似乎都是一个永恒的话题。针对某一类物质的分离，人们通过寻求它们之间的共性特征而发明了诸多的分离纯化技术。然而随着人们对某一特定目标产物活性与纯度的需求逐渐增大，但同类物质之间彼此性质的相似性使得精确的分级难度随之加大，二者之间的矛盾刺激人们不断探索新的技术以提高纯化水平。人们清楚地意识到，要想使目标物得到分离，目标物与杂质之间的性质差异必须足够大，这又与某些性质差异小的物质的分离相矛盾，而人为放大这些差异小的性质必然会破坏目标物的原有结构，因此需要借助第三者进行差异转化，即以其自身的性质为基础，转化为其他方面差异大的性质。层析法就是通过层析介质与流动相的共同作用，使被分离物质之间差异很小的性质随流动相的流动而转化成了速度上的差异，通过时间上的积累进而转化为距离上的差异。所以，从理论上来说，只要层析柱足够的长，纵使是很微小的速度差异也能够体现出一定的距离上的差异，从某种意义上来说对于层析法也就不存在无法分离的物质，这是层析法在生物大分子的分离纯化中占据主导优势地位的原因。此外，除了定性能力较差以外，层析法几乎囊括了物质分析纯化中的所有优点，比如分离效率高、速度快，样品用量少、检测灵敏度高、分析速度快、易于自动化管理等。基于不同的原理，层析法又衍生出诸多的操作技术，在实际应用中可以根据待分离物质的特定性质选择适合的操作技术。基于以上种种原因，层析法在分离高纯度、高活性的生物大分子中有着不可替代的作用。本实验以分子筛层析完成麦清蛋白脱盐为实例验证层析技术的可行性，了解相关技术的应用及新技术的发明对边缘性实验学科的重要作用，感悟技术发明的思路。二、原理1.硫铵分级沉淀中性盐沉淀的原理是大量中性盐加入使水活度降低，它们在争夺溶剂水的同时破坏蛋白质表面的水化层，使疏水氨基酸暴露，从而发生聚集沉淀下来。由于不同蛋白质所形成的双电层水膜的稳定性不一样，因此破坏他们所需的硫酸铵的浓度也不一致，所以我们可以利用不同浓度的硫酸铵来对样品液进行分级沉淀，特定的浓度可以使样品中一类蛋白甚至是一种蛋白质发生沉淀。显然，硫酸铵分级沉淀在对蛋白质的粗提取过程中实际上已经实现了精细分级（除去了一部分蛋白杂质），这符合实验设计中尽可能使每一步实现效益最大化的原则，所以被用作蛋白质粗分级中的常用手段。此外，硫酸铵还有其他的一些优势：（1）硫酸铵属于惰性物质，不易与其他生物活性物质发生反应，在纯化过程中能最大程度的保护蛋白质活性，不易使蛋白质变性；（2）硫酸铵为二价离子，等浓度时离子强度高，能更有效的降低蛋白质溶解度；（3）硫酸铵在水中的溶解度大、温度系数小，在低温时仍可以高浓度存在，既能够满足低温沉淀某些蛋白质的需要，又能有效争夺溶剂水和破坏蛋白质水化层，使蛋白质有效沉淀；（4）硫酸铵溶解性好也为后续的高盐纯化做准备，便于洗涤去除。2.凝胶过滤层析凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱；相对分子质量较小的物质可自由地进出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱；中等大小的分子在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这样，由于分子量大小不同的物质被洗脱的时间是一定的，经过层析柱后，混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。3.实验方案本实验选取麦清蛋白作为纯化对象进行研究，我们首先通过硫铵分级沉淀对小麦种子提取液做初步的提纯，得到含有硫酸铵杂质盐的麦清蛋白粗提取物，然后通过分子筛层析除盐，最后利用紫外分光光度计测定各阶段纯化产物的OD280以检测蛋白含量，同时用BaCl2检测纯化产物中有无硫酸根离子，最后对比分析麦清蛋白和盐的洗脱曲线来评判凝胶过滤层析的除盐效果。三、仪器与试剂仪器：UV9600紫外分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）、JP-100架盘药物天平（常熟市双杰测试仪器厂）、TDL-40B低速离心机（上海安亭科学仪器厂）、SL-200型高速多功能粉碎机（浙江省永康市松青五金厂）、BSZ-100自动部份收集器（上海沪西分析仪器厂）、HL-2恒流泵（上海沪西分析仪器厂）；器具：微量可调手动移液器（大龙）、研钵；试剂：饱和（NH4）2SO4溶液、1%的BaCl2溶液、洗脱液、蒸馏水；材料：新鲜小麦种子、葡聚糖凝胶G-25。四、实验步骤11.溶胀凝胶（教师完成）称取交联葡聚糖凝胶G-25适量，加入足量的洗脱液于沸水浴中溶胀5h。溶胀平衡后，适度搅拌使充分悬浮后稍静置，待大部分凝胶沉降后，除去含有细碎颗粒的上层液，如此反复操作多次直至无细微颗粒为止。最后将漂洗好的凝胶在真空干燥器中减压除气。2.装柱打开层析柱柱帽，下端止水，装入1/4左右柱长的洗脱液。将凝胶边搅拌边倒入柱中，同时开启洗脱，使凝胶一直处在溶液中，一次性连续装柱直至柱长的3/4左右。装柱完成后适时止水以使洗脱液面高于凝胶面35cm，待凝胶沉降完成后，旋上柱帽，连接洗脱系统，平衡洗脱约3h。3.盐析法分离提取麦清蛋白取小麦种子，粉碎，称取2g于三角瓶。加20ml蒸馏水，连续震荡1h，3000r/min离心20min。取上清液，搅拌下加入等体积的饱和硫酸铵溶液，冰箱冷藏4小时左右使麦清蛋白充分沉淀出来。随后以3000r/min离心20min，弃上清液，加3ml去离子水溶解沉淀，即得麦清蛋白粗品水溶液。4.上样打开柱帽，放入略小于层析柱内径的滤纸片，使其自然飘落在凝胶面上。连接收集系统，确定流速（10滴/s），准备上样。利用恒流泵加速按钮使洗脱液面与胶床表面相齐时，停止洗脱。用加样器取1.5ml样品提取液，小心滴入凝胶床面中央，然后开启洗脱，同时开启收集器。待样品与凝胶面相齐时，迅速用滴管加入略高于上样高度（1.52cm）的洗脱液，如此操作23次。待洗脱液再次与凝胶面相齐时，用滴管小心加入35ml高的洗脱液，旋上柱帽，连续洗脱收集。5.洗脱、收集与鉴定每3毫升收集一管，然后以洗脱液作为空白管，用紫外分光光度计测定各收集管的OD280值。记录每管的消光值，以管号为横坐标，消光值为纵坐标，绘制洗脱曲线。比色完毕后，确定峰值管，并留取样液250l，随后向各管分别加入2滴1%的BaCl2溶液，混匀观察是否产生白色沉淀，比浊法比较脱盐效果。五、数据整理及图表表1 凝胶过滤层析提取麦清蛋白数据整理管号12345678OD2800.0270.0330.0280.0270.0230.6121.1640.229沉淀管号910111213141516OD2800.1140.1020.0910.0850.0730.058沉淀+注：“”表示洗脱液加入BaCl2后无沉淀，即盐含量为0；“+”表示洗脱液加入BaCl2后无沉淀，即洗脱液中含有盐。注：“0”表示洗脱液加入BaCl2后无沉淀，即盐含量为0；“1”表示洗脱液加入BaCl2后无沉淀，即洗脱液中含有盐。六、讨论与分析（1）从图1可以看出，麦清蛋白洗脱曲线有一个明显的洗脱峰，峰值管（蛋白质含量最高）为第7管。进一步分析发现，洗脱峰两侧（特别是右侧峰值管之后）较为平缓而不是呈现尖锐的形态，原因应该是上样时样品滴加速度过慢且上样后用洗脱液淋洗层析柱内壁时加入洗脱液的量过多所致。（2）从图2可以看出，盐的洗脱曲线其洗脱峰同样比较平缓。就本实验而言，我们并没用很精确的方法对洗脱液中盐含量进行定量，只是通过BaCl2沉淀法判断洗脱液中是否存在盐（硫酸根离子），而用肉眼观察确定沉淀的大致产生量还是有较大误差的，故所绘盐的洗脱曲线仅供参考。（3）对比图1、2，麦清蛋白的洗脱峰与盐的洗脱峰相隔距离还是比较近的，大概只有一管的差距。正常情况下，两种待分离物质的洗脱曲线中，峰值管之间至少应该相差34管，这种情况下才能认为是两种物质达到了有效分离。故坦率的讲，本实验并没有有效地对麦清蛋白进行脱盐，也没有达到预期的目标。七、结论与展望（1）由本实验的结果我们可以看到，分子筛层析是具有可操作性的，但若要保证其分离效果，就需要严格的规范熟练操作。拿我组实验来说，由于是初次接触此类实验，经验不足，所以操作过程中的一些要点没有把握好，造成最终实验结果并不理想。（2）通过本实验，我们对层析技术有了一个较深的认识。在目前生物大分子的分离纯化中，层析占据着主导优势，但是随着生命科学的不断向前发展，在物质的分离纯化方面必然会出现实际操作中层析技术解决不了的问题，所以新的分离纯化技术肯定还会产生。八、质疑与相关思考（1）如何改进本实验使洗脱液中的盐含量能够定量检测？个人认为在原有操作的基础上可各管将所的沉淀进行离心，计算所得沉淀量，进而得出盐的洗脱量。（2）实验中洗脱液的流速为10滴/s，这是如何确定的？是前人的实验总结而来的吗？进一步来讲，在进行柱层析时洗脱液的流速确定是不是有什么规定或者参考标准？（3）本实验中盐的洗脱曲线其洗脱峰非常平缓（较宽），原因可能是上样后环壁淋洗加入的洗脱液体积过多，导致样品进入凝胶柱过慢，从而增加了洗脱峰的宽度。（4）在实验最终洗脱的过程中，我组的恒流泵似乎出现了问题，洗脱速度一直在发生变化，导致相同时间内收集得到的洗脱下来的液体的量明显不一样。虽然我们几经调整，但流速始终没有稳定在一个确定的值。我想这应该也是本次实验失败的原因之一。九、思考题用分子筛凝胶柱层析法分离混合样品时，为了得到较好的分离效果，根据技术的理论特点，你认为在实验前的实验设计阶段主要要注意哪些方面？为什么？而在实验的具体操作方面，你认为关键步骤又有哪些方面？为什么？1.实验设计时的注意事项在实验设计时必须要对实验进行一个总体上的定位。具体来讲，在使用分子筛层析分离混合样品时，首先应该明确实验目的，如对生物大分子进行分离纯化、测定生物大分子的分子量或者是脱盐及除去小分子杂质等。在明确目的的前提下，就需要注意以下几个方面：（1）凝胶介质的选择，包括凝胶的种类、交联孔径以及粒度等。凝胶的材质需为化学惰性，与分离物不能产生变性或是其它化学反应，最好具有能长期反复使用的稳定性，并可以在较大的pH和温度范围内使用。由于凝胶上的离子交换基团会吸附带电荷的物质，产生离子交换的效果，所以凝胶上最好不具有离子交换的基团。此外，凝胶要有一定的机械强度，在层析过程中才不会变形，增加机械强度也可使层析在较高压力的环境进行，缩短分离时间。凝胶颗粒的粗细与分离效果有直接关系，颗粒细的分离效果好，但流速慢而费时，因此要依据实际的需要来选择。对于分子量较小的物质，一般采用交联葡聚糖或聚丙烯酰胺材质的凝胶，大分子物质则使用琼脂糖凝胶。此外对于分子量相差悬殊的类分离（如脱盐），应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小分子组的分子量小于渗入限；对于分子量相差不大的分级分离，更多使用小颗粒凝胶以提高分辨率。3（2）层析柱的选择。选择时较多考虑待分离组分之间的差异程度，如果要分离的分子大小相差很多，则可选用柱高：直径5：115：1的管柱，且管柱体积要大于415倍的样品体积；如果要分离的物质之间分子量差异不大，则要选用柱高：直径20：1100：1的管柱，且管柱体积要大于25100倍的样品体积。所以凝胶柱越长，分离效果越好，但是同时伴随的是分离时间的增加与成本的提高。具体地，在进行类分离（如脱盐）时，柱高50cm比较合适；分级分离时，100cm较为合适。（3）洗脱液的确定。理想的凝胶过滤层析中，待分离物质只与流动相发生作用而被洗脱。但在实际操作中，作为固定相的凝胶毕竟还不是理想的层析介质，是由化学物质组成的，所以都会或多或少带有电荷而与待分离物质发生电荷作用，造成固定相与流动相之间的竞争性吸附作用，从而使分离过程偏离我们的理论设想，故在选择洗脱液时要考虑尽可能减弱甚至消除该影响。就本实验来说，凝胶介质为交联葡聚糖，其分子中含有大量的羟基，在水相中带负电荷，会与我们要分离的目标蛋白质发生电荷作用，所以洗脱液常用磷酸缓冲液以中和凝胶介质所带电荷。此外，缓冲液还应该不与目标物及凝胶介质发生反应或改变其性质。（4）洗脱速度与收集量的把握。一定程度上讲，洗脱速度越慢，分离的效果越好，但需要时间较长；如果速度太快，各组分都会被快速流动的洗脱液带动前进，从而使分子筛的分辨率下降，两种物质洗脱峰之间差距小，分离效果下降。此外，洗脱速度如果过大，洗脱液产生的拉力效应也会使凝胶颗粒变形，从而影响分离效果，所以应该在保证分离效果的前提下确定洗脱速度。每次的收集量越少，所绘出的洗脱曲线就越准确，所以理想的收集是逐滴收集，然后测定每滴中待分离物质的含量，而这种方法带来的成本较高，可操作性太差。实际中应在考虑可操作性的基础上以最短时间段内分次收集洗脱液。以本次实验为例，考虑到紫外分光光度计测定样品光吸收时的最小样品量为2.7ml，最多为4ml，另外还有转移时的损失且要保证准确性，每次收集量定为3ml。2.具体操作中的关键步骤（1）溶胀凝胶首先，应使凝胶充分溶胀平衡，否则装柱后凝胶柱会有破裂的危险；其次，凝胶处理过程中不能剧烈搅拌，如此易使颗粒破裂，影响流速；最后，凝胶在装柱前应该充分悬浮沉降，然后除去细碎颗粒和杂质，得到均一合格的凝胶。（2）装柱装柱前先向层析柱中注入1/41/3的洗脱液，目的是避免灌胶时凝胶颗粒堵塞筛绢以及直接撞击到底部而使自身孔径发生改变。灌胶的时候应该在搅拌状态下进行一次性灌胶，使体系保持一致。具体做法是凝胶柱内会形成两个界面，自下而上分别是凝胶相、混合相和洗脱液相，这两个界面会逐渐靠近，使凝胶相和洗脱液相长度增加，混合相长度缩短。每次倒入凝胶之后，随着洗脱的进行，凝胶柱内液面下降，在两界面相遇之前，搅拌下进行下一次灌胶。直至最后使凝胶相的长度为柱长的3/4左右时停止，这样才可以使我们得到外观上均一的凝胶柱。还要适时止水，保证洗脱液面高于凝胶面35cm，目的是起一个缓冲作用，避免平衡时洗脱液冲毁凝胶柱。最后要充分平衡洗脱3h左右。原因是组成凝胶柱的细小颗粒在我们肉眼可见的稳定下，由于流动相的洗脱，微观上凝胶颗粒还有滚动、晃动等运动。平衡的作用就是在流动相的洗脱下，使每一个凝胶颗粒达到完全静止的状态，成为真正意义上的固定相。（3）上样样品的准备。样品粘度大会产生介质吸附，一般要求其粘度小于0.01Pas；样品浓度以不大于4为宜，样品浓度过大往往导致粘度增大。如果样品浑浊，应先过滤或离心除去颗粒后上柱；样品的体积也有要求，分析用量一般应低于总柱体积的5%，制备用量一般为15%或更多（2030%）。在层析柱内放入略小于其内径的滤纸片，其作用有三个：保湿，使凝胶上界面不至于干燥；缓冲作用，避免上样时样液冲刷破坏凝胶柱；截流作用，滤去样液中的一些不溶性杂质，避免其堵塞凝胶孔径。上样及随后加洗脱液冲洗时要把握好最佳时机，即洗脱液面与胶床表面相齐的一瞬间。过早会稀释样品，使最终蛋白质不能集中洗脱；过晚则凝胶脱水甚至造成干柱，会直接导致实验失败。上样时要小心谨慎，应该使用胶头滴管或者液枪将样液缓慢逐滴滴加到滤纸正中央，滴加速度过快会冲毁凝胶柱，直接对结果产生影响。待样品液与凝胶上界面相齐时，需要用滴管环壁加入略高于上样高度的洗脱液冲洗23次。原因是有部分样品沉积在层析柱内壁上，环壁加入可使其充分淋洗下来；另外加入缓冲液的体积对洗脱峰也有影响，体积过多会使样品进入凝胶柱过慢最终导致麦清蛋白的洗脱峰与盐的洗脱峰宽度增加，过少有可能出现第二个较低的洗脱峰（次峰），二者都会影响分离效果。（4）凝