westernblot经验.doc

根据自己的实验体会，总结做好WB的一些心得，与大家分享，不当之处欢迎批评指正。叙述的思路就是围绕着实验的每个步骤展开，这样可能更具体些。1配胶: 该部分较为重要的是配制凝胶时要充分混匀，此外应保证试剂的新鲜。常出现的问题有：A.凝胶出现花纹：此时应检查原料中过硫酸铵（AP）粉末是否受潮B.凝胶聚合时间较长：聚合时间由AP以及TEMED决定，通常在30min左右，AP不新鲜会导致聚合变慢：此外还需注意环境的温度也很重要，气温较低时胶是会凝得慢一些，必要时可适当增加AP以及TEMED的量，但通常不会超过1h，若超过1h甚至更长仍未聚合，应检查配制的操作有无错误。2处理蛋白样品：该部分蛋白样品本身很关键，若蛋白提取过程存在问题或蛋白发生降解则很难进行好之后的实验，也就很难做出好的结果了；除此之外loading buffer的作用也不容忽视，切莫使用不新鲜的上样缓冲液，同时在处理时将样品与loading buffer混合均匀也应注意。3电泳:首先在跑积层胶时应尽可能使样品压齐，若上样量较大（如细胞蛋白通常上样在20-30甚至40ul）,可适当减小电压跑20-30min，待压齐后方可开始分离。4转膜:该环节电流的大小，转膜的时间决定是否能成功将蛋白转上，而具体的参数应取决于所要蛋白的分子量大小，应反复摸索，本人在实验中得出的经验为：10KDa:200mA 1h; 60KDa 70V,2h；90KDa 70V,4h；200KDa 70V,6h. 此外还有如下几个细节问题需要注意：A.膜的选择：PVDF还是NC,0.22m还是0.45mB.转膜液中甲醇的量：通常在10%-20%，蛋白分子量较大时可适当减少，蛋白分子量小时应适当增加，建议先从15%开始。5封闭:该步骤一般不易出现问题，常见的有室温2-3h，或者4度封闭过夜，但仍需强调一点的是有些抗体的使用需配套使用特殊的封闭液。6一抗孵育:通常购买到一种新抗体后，还是建议先按说明书推荐的浓度比例在室温孵育2-3h, 若该抗体效价较好，应该显带很漂亮，尤其是在抗体刚买时间不长，然而事情往往不能尽如人意，我们在遇到一个不好的抗体时该怎么办？可通过延长孵育时间（如：4度过夜孵育甚至室温过夜孵育），增大抗体浓度，如果你想尽了一切可能结果仍然很不理想，建议还是换抗体吧，不要再浪费时间与精力了。7洗膜: 个人认为洗膜液洗3遍，每遍10min足以，没有必要过多次数过长时间，膜的背景不好很多时候并不是没洗干净，更多的应该去考虑抗体浓度是否过高等其他原因，本人实验过程中曾经做过两个抗体，其他的条件一样（甚至是从一张膜上剪开的），背景却相差很大，你能说是没洗干净吗？洗二抗同样如此8二抗孵育：选择好一个合适的条件不要轻易改变，另外相比一抗，二抗作用的时间应严格控制，实践证明一抗时间长点可能没什么关系，而二抗时间若过长过短都将会直接影响结果。9扫膜:本人的实验室使用的是odyssey机器，该机器及相应软件操作简便，使用起来也很智能，这里就不多说了。以上是本人在实验过程中不断总结得出的一点小小体会，没有华丽的语言，没有高深的理论，只是希望能对刚刚接触western blot实验的朋友有点帮助，可能真正接触了实验后才能更好的去思考去总结，其实不只是western blot，可以说很多实验真的是细节决定成败，也许当我们认真做好每一个环节好的结果自然就水到渠成了，还是做个有心人吧，天才来自勤奋，成功源于积累！有什么新的心得体会，我将会及时补充，同时也希望各位战友批评指正！1 转录因子或丰度较低的蛋白质或转录因子：在室温孵育3或4个小时发不出来时可以转到4度15个小时一定可以发出来。背景可能会深点（可以在发光时先垫一张用过的胶片挡一下背景，上面的爆光就会好不少）2碧云天的TUBLIN一抗释然液也会有过期的时候，为此耽误了近一个周的时间！一抗释然最好用新鲜的牛奶或负20度保存的BSA或PBS。3如果二抗加多了，或洗得不干净，荧光淬灭时间会非常短，此时可以一次拿出几张片子，连续压片，然后依次显影并定影。这样可以保证在荧光淬灭之前把其真实的比例记录下来。4 如果你的蛋白浓度不高，但需要加30ul才能保证目的条带发出来的话，可以浓度下面的方法：在梳子拔蓖麻出后直接加样品，然后用电流液补齐满，最后加电流液，这样也不会使样品被电流液冲出来。效果非常好。5 MARKER 最好别上在最边上，这样跑出来的条带非常不好看，也不容易判断蛋白质的位置。先分享这些有后有体会再分享1.准备各溶液。 小烧杯两个，5ml枪头6个，吸水纸，罐胶电泳设备。2.准备罐胶槽。 将玻璃板擦干净，放入短架子内，薄板靠门，两玻璃板及架子的底缘须在同一平面（否则漏胶）；将湿润的垫片垫于长架子上并铺上密封膜；将短架子装在长架子上（短架子底缘须与垫片紧密接触，否则漏胶）。3.准备配胶。将各溶液（ddH2O，单体，Tris-HCl，SDS，TEMED，APS）依次摆好，5ml枪头插于长罐胶槽，调好取TEMED、APS的枪。4.配分离胶。在一小烧杯上装半杯ddH2O；另一小烧杯依次加上述各液（加TEMED、APS时要迅速），快速摇匀。 注：胶浓度由需要检测的蛋白大小决定。5.罐胶。 从玻璃板中间注入胶液，注胶速度均匀，不要产生气泡。罐胶后用ddH2O压胶。6.等待时： 将Tris-HCl换成pH6.8。换取Tris-HCl及罐胶用的枪头。调好各移液器。7.30分钟后。倒掉压胶水，用滤纸吸干残留水，注意不要触及胶面。8.配集成胶。参见步骤4。9.罐胶。 参见步骤5，灌满为止，不要有气泡。10.插梳。 梳柱下面不要有气泡。11.等待时。 A：配电泳缓冲液。B：将样本煮沸5分钟。C：水中冷却，短暂离心后依加样序排放好。D：等胶近凝时，将玻璃板装在电泳架子上，罐内槽液于槽中，检查是否密封。E：将上槽架子按于槽中。12.30分钟后。 罐上槽液超过短玻璃板，拔梳（注意力道适中，不能太快）。放置上样架子。13.上样30l。 枪头先伸入至快接近胶面时开始降将上样液缓缓打出，使样品液从胶面往上涨，枪头随液面上涨而上提。可以不把最后一滴样品打出，但是每个样品都须同样处理。14.加外槽液。15.电泳。转膜：1.准备。 分别准备泡膜和转膜用的试剂和用具，在电泳槽中倒好转膜液2.揭胶。 电泳结束后，将电泳槽移至水池中，倒掉电泳液，将内槽提起放在水池边，取出两边玻璃板。用纯水冲干净玻璃板，小心揭开短板，去掉集成胶，小心将胶转入转膜液在中。3.转膜。 将夹子打开，黑色在底，依次放置海绵、滤纸、胶、膜、滤纸、海绵，关好夹子（均在液面下进行，注意气泡）快速放入架子中。在电泳槽中放冰袋。4.电泳。封闭及孵抗体：1.转膜等待时准备封闭液（即Non-fat milk 5% in TBST）。2.转膜完毕后， 将膜放