响应面优化乳杆菌菌株产共轭亚油酸的工艺研究.doc

响应面优化乳杆菌PC-3菌株产共轭亚油酸的工艺研究摘 要：以共轭亚油酸(CLA)转化率为考察指标，研究乳杆菌PC-3菌株转化生产CLA的发酵工艺。在单因素试验中考察培养基种类、乳糖与硫酸铵添加量比、菌液接种量、培养时间、亚油酸添加量、吐温-80添加量对CLA转化率影响的基础上，采用三因素三水平响应面试验设计优化乳杆菌PC-3菌株产共轭亚油酸的工艺条件。结果表明：乳杆菌PC-3菌株产共轭亚油酸的较佳条件为：诱导培养基为MRS培养基、乳糖与硫酸铵添加量比3:2、接种量3.0%、培养时间43.0h、亚油酸(LA)添加量(体积分数)1.30、乳化剂吐温-80添加量2.00g/L，此条件下CLA转化率达到6.87%，理论值可达6.96%，实验值与理论预测值的相对误差为1.29%。关键词：共轭亚油酸；乳杆菌PC-3；响应面分析法；优化Optimization of Medium Composition and Culture Conditions for Conversion of Linoleic Acid toConjugated Linoleic Acid by Lactobacillus PC-3Abstract：Themediumcompositionandcultureconditionsforconversionoflinoleicacid(LA)toconjugatedlinoleicacid(CLA)byLactobacillusPC-3wereoptimizedbyresponsesurfacemethodologytoobtainmaximumconversionefficiencyofCLA.Culturemediumtype,lactose/ammoniumsulfateconcentrationratio,inoculumsamount,culturetime,LAconcentrationandTween-80concentrationwereinvestigatedbyone-factor-at-a-timeexperiments.Athree-variable,three-levelresponsesurfacedesignwasusedtooptimizeinoculumamount,culturetimeandLAconcentration.TheresultsshowedthattheoptimalconversionconditionsofLAwasMRSmedium,inoculumsamountof3.0%,culturetimeof43.0h,LAconcentrationof1.30andTween-80concentrationof2.00g/L.Undertheoptimizedconditions,theexperimentalconversionefficiencyofCLAwas6.87% compared to 6.96% from theoretical predictions, showing a relative error of 1.29% between both.Key words：conjugated linoleic acid；LactobacillusPC-3；response surface methodology；optimization中图分类号：Q815文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)19-0213-06doi:10.7506/spkx1002-6630-201319044收稿日期：2012-07-30基金项目：安徽省年度重点科研项目(12070403077)作者简介：章立新(1987)，女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：*通信作者：王武(1968)，男，副教授，硕士，研究方向为农产品生物化工。E-mail：共轭亚油酸(conjugatedlinoleicacid，CLA)是由必需脂肪酸中的亚油酸(linoleic acid，LA)衍生的，是具有共轭双键的18碳原子的不饱和脂肪酸的多种位置和几何异构体的总称1。研究发现2-3，c9,t11-CLA和t10,c12-CLA具有增强免疫调节、抗动脉粥样硬化、抑制癌症、减肥、抗氧化等生理功能及保健作用，同时，CLA还具有改善骨组织代谢、调节血糖4等功效。目前，CLA主要由化学法和生物法合成得到，化学合成法的产物异构体众多，成分复杂，分离提纯困难，制约了其在食品医药领域的应用，也导致CLA单体在该领域处于垄断地位5。生物合成法因其反应条件温和，产物成分较单一，在食品医药领域展现出了良好的应用潜力。目前，用来生物合成CLA的微生物主要有丁酸弧菌(Butyrivibrio)、丙酸杆菌(Propionibacterium)、乳酸杆菌(Lactobacillus)等，这些菌株均可经诱导产亚油酸异构酶，转化生产具有生物活性的CLA。但丁酸弧菌需要严格厌氧培养，合成的异构体种类较复杂，应用受到限制；而乳酸菌系益生菌，且酶的作用位点在脂肪酸的c12双键上，能把LA转化为c9,t11-CLA，产物可直接从细胞培养液中提取6，其发酵条件温和、易控制，生产设备简214 2013, Vol.34, No.19 食品科学 生物工程单，具备工程化的应用潜力，筛选较高的CLA转化率的乳酸菌属菌株仍是当前的研究热点。PC-3菌株系从黄瓜泡菜、萝卜泡菜、豇豆泡菜等环境中筛选出，能转化亚油酸为具有生理活性的共轭亚油酸(c9,t11-CLA和t10,c12-CLA)，经形态学、生理生化实验及16S rDNA序列分析，结合气-质联用仪检测方法，鉴定PC-3菌株为乳杆菌属，该菌株能转化LA为具有生理活性的CLA。本实验以该菌株为研究对象，优化其发酵生产CLA的工艺条件。该工艺条件易实施、易实现工业化。1 材料与方法1.1材料、试剂与仪器1.1.1菌种与培养基乳杆菌PC-3，自黄瓜泡菜、萝卜泡菜、豇豆泡菜等环境中分离出。MRS培养基，121灭菌20min；脱脂乳培养基(12g/100mL)，115灭菌15min。1.1.2试剂亚油酸C18:2(LA含量(951)%，酸值190mgKOH/g，水分含量0.1%)安庆市中创生物工程有限公司；共轭亚油酸(CLA含量99%)、CLA甲酯(99%)美国Sigma公司；c9,t11-CLA(含量90%)、t10,c12-CLA(含量90%) Nucheckprep公司；正己烷 江苏强盛功能化学股份有限公司；脱脂奶粉(脂肪含量1.5g/100g，优质蛋白含量32g/100g)内蒙古伊利实业集团股份有限公司。1.1.3仪器与设备SW-CJ-1F超净工作台 苏净集团安泰公司；HQ45Z恒温摇床 中国科学院武汉科学仪器厂；CT14RD台式高速冷冻离心机 上海天美生化仪器设备工程有限公司；CP-Sil 88色谱柱(100m0.25mm，0.20m)美国Varian公司；QP-2010气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司。1.2 CLA的测定及标准曲线制定1.2.1 GC-MS检测条件7气-质联用仪CP-Sil 88色谱柱(100m0.25mm，0.20m)，升温程序为70维持10min，以5/min速率升温至170，维持15min，再以2/min升温至190，1/min速率升温至210，维持20min。进样口温度为220，检测器温度为220；柱前压为182.2kPa，柱流速为0.8mL/min；氢气流速为50.0mL/min，空气流速为400.0mL/min；分流比为1:30；进样量为1L。采用电子电离源(EI)，离子阱温度为250，连接口温度为220，采用全离子扫描方式，扫描质量(m/z)范围为100350。1.2.2 CLA标准曲线的制定吸取200L的CLA甲酯标准样品，正己烷定容于25mL的容量瓶，配制为8L/mL，分别移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL定容至1mL，转移至7个气相色谱自动进样瓶中，进行GC-MS分析。并以CLA的添加量为横坐标(x，L/mL)，峰面积为纵坐标(y，104)，建立CLA气相色谱标准曲线，得出回归方程y=3.0246x0.0604(R2=0.9989)，线性相关范围04.8L/mL。1.3 CLA转化率的测定1.3.1诱导产酶与发酵培养菌株接种于MRS液体培养基活化2次后，以体积分数2.5%的接种量接种乳杆菌PC-3菌株于添加有1.50亚油酸的MRS液体培养基中，诱导菌株产亚油酸异构酶(其转化LA为CLA)8-10，37恒温120r/min摇床培养36h，获得具有共轭亚油酸异构酶的菌细胞。再次转接菌株，进行发酵产CLA的优化实验。1.3.2分离萃取发酵后的培养液经4、6000r/min离心10min，取发酵液。采用正己烷萃取发酵液，静置，收集上面的正己烷层。在正己烷溶液中加入无水硫酸钠吸水干燥，于30旋转蒸发，去除有机溶剂，得脂肪酸提取物收集在试管中，备用。1.3.3脂肪酸甲酯的制备加入25L的脂肪酸提取物和1mL的2% H2SO4甲醇溶液于试管中，在55条件下进行甲酯化(10min)，随后用正己烷萃取，蒸馏水洗涤2次，静置，取上层待测。由CLA标准曲线得CLA含量，再根据底物LA的添加量计算出CLA的转化率(每个水平实验3次)。转化率/%= 100CLA含量/(L/mL)LA添加量/(L/mL)1.4单因素及响应面试验以CLA的转化率为响应指标，确定较适的发酵培养基(MRS液体培养基与脱脂乳培养基)，考察乳糖与硫酸铵添加量比、菌液接种量、培养时间、底物LA添加量、乳化剂吐温-80的添加量对CLA转化率的影响。1.4.1发酵培养基的种类对CLA转化率的影响MRS液体培养基和脱脂乳培养基都可以作为菌株的发酵培养基，以乳杆菌PC-3菌株为研究对象，活化2次后转接于这两种培养基。亚油酸添加量为1.50，菌液接种量为2.5%，混匀后于37、120r/min摇床培养24h。然后正己烷萃取发酵液，测得菌体对CLA的转化率。1.4.2乳糖与硫酸铵的添加量比对CLA转化率的影响发酵培养基中乳糖和硫酸铵的添加量比分别为2:1、3:2、1:1、2:3、1:2(其中乳糖添加量依次分别为0.20、0.18、0.15、0.12、0.10g/100mL)，亚油酸添加量为1.50，经LA诱导过的菌液接种量为2.5%，37、120r/min摇床培养24h。以不添加乳糖和硫酸铵的发酵培养基作为参照，考察CLA的转化率情况。生物工程 食品科学 2013, Vol.34, No.19 2151.4.3菌液接种量对CLA转化率的影响乳糖和硫酸铵的添加量比为3:2，亚油酸添加量为1.50，经LA诱导过的菌液接种量为0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%的发酵条件下，37、120r/min摇床培养24h后分别测得CLA的转化率。1.4.4培养时间对CLA转化率的影响乳糖和硫酸铵的添加量比为3:2，亚油酸添加量为1.50，经LA诱导过的菌液接种量为2.5%，发酵培养时间分别为12、24、36、48、60h，37、120r/min摇床培养。然后测得CLA的转化率。1.4.5底物亚油酸的添加量对CLA转化率的影响考察亚油酸添加量分别为0.50、1.00、1.50、2.00、2.50对菌体生长的影响。乳糖和硫酸铵的添加量比为3:2，经LA诱导过的菌液接种量为2.5%，37、120r/min摇床培养36h。1.4.6乳化剂吐温-80的添加量对CLA转化率的影响底物亚油酸添加量为1.50，其他条件相同的情况下，考察吐温-80的添加量分别为0、0.50、1.00、1.50、2.00g/L对CLA转化率的影响。1.4.7响应面试验设计通过Excel软件进行单因素方差分析。在此基础上，选出具有显著性差异的3个影响因素(接种量、培养时间、亚油酸添加量)进行响应面试验。按Box-Behnken中心组合设计原理，确定3个影响因素水平的中心点，取3个水平。2 结果与分析2.1 GC-MS检测结果0.00.51.01.550 55 60 65 70 75LAabA/minV(m017)100755025050 100 150 200 250 300OOOBm/z%/678155594138449593109123135150164178207220234263281294313100755025050 100 150 200 250 300OOCm/z%/678155594138449593109123135150164178207220234263281294313A.气相色谱图；B. a峰的质谱图；C. b峰的质谱图。图 1 气相色谱图与质谱图Fig.1 GC-MS analysis of CLA sample由图1可知，a峰和b峰能较好的分离开(图1A)，出峰时间分别为65.905min和66.551min，与c9,t11-CLA甲酯、t10,c12-CLA甲酯的出峰时间相吻合，并具有分子离子峰m/z为294(图1B、C)。说明a峰为c9,t11-CLA，b峰为t10,c12-CLA11-13，乳杆菌PC-3菌株能将LA转化为两种具有生物活性的CLA异构体c9,t11-CLA和t10,c12-CLA。2.2发酵培养基的种类对CLA转化率的影响01234567MRSLAC%/图 2 两种培养基对CLA转化率的影响Fig.2 Effect of culture media on the conversion efficiency of CLA由图2可知，转接经LA诱导后的菌株进行发酵培养的CLA转化率要高于直接进行诱导培养的，证实了乳杆菌PC-3菌株产生亚油酸异构酶转化LA为CLA，减弱LA对其生长的抑制作用。MRS培养基中的CLA转化率高于脱脂乳培养基中的CLA转化率，说明MRS培养基是转化LA为CLA的较适宜培养基。2.3乳糖与硫酸铵的添加量比对CLA转化率的影响12345670:0 2:1 3:2 1:1 2:3 1:2LAC%/图 3 乳糖与硫酸铵的添加量比对CLA转化率的影响Fig.3 Effect of lactose/ammonium sulfate concentration ratio on theconversion efficiency of CLA216 2013, Vol.34, No.19 食品科学 生物工程由图3可知，乳糖与硫酸铵添加量比对CLA转化率的影响不显著(P0.05)。乳糖作为PC-3菌株产CLA的碳源，硫酸铵作为氮源14，与牛肉膏结合使用，影响菌株的生长。当乳糖与硫酸铵的添加量比为3:2时，CLA转化率是最高的，从而选出较适宜产CLA的乳糖与硫酸铵添加量比。2.4菌液接种量对CLA转化率的影响12345670.5 1.5 2.5 3.5 4.5/%LAC%/图 4 菌液接种量对CLA转化率的影响Fig.4 Effect of inoculum amount on the conversion efficiency of CLA由图4可知，菌液接种量对CLA转化率的影响显著(P0.05)。转化LA为CLA主要是由亚油酸异构酶起作用，增加接种量可以提高酶量，对产CLA有利。而接种量过大，会影响到菌株生长，再加上培养基中营养成分的减少，抑制菌株的新陈代谢，导致亚油酸异构酶活性降低。故当菌液接种量为2.5%时，CLA转化率是最高的。2.5培养时间对CLA转化率的影响/hLAC%/123456712 24 36 48 60图 5 培养时间对CLA转化率的影响Fig.5 Effect of culture time on the conversion efficiency of CLA由图5可知，培养时间对CLA转化率的影响显著(P0.05)。随着培养时间的增加，CLA转化率增加，而当培养时间为36h时，CLA转化率达到最高，继续延长培养时间，CLA转化率下降，可能是菌株代谢物及生长环境pH值的改变影响了亚油酸异构酶的酶反应体系和酶活力。2.6底物亚油酸的添加量对CLA转化率的影响由图6可知，亚油酸添加量对CLA转化率的影响显著(P0.05)。共轭亚油酸的转化需要亚油酸的诱导，则直接添加亚油酸比较好15。Dawson等16认为，细菌为了减除LA对菌细胞生长的毒害，产生亚油酸异构酶来转化LA为CLA，但LA添加量加大，对亚油酸异构酶有抑制作用，降低酶活性，使得CLA转化率下降。当LA的添加量为1.50时，CLA转化率是最高的。2345670.5 1.0 1.5 2.0 2.5LA /LAC%/图 6 亚油酸添加量对CLA转化率的影响Fig.6 Effect of LA concentration on the conversion efficiency of CLA2.7乳化剂吐温-80添加量对CLA转化率的影响012345670.0 0.5 1.0 1.5 2.0-80 /(g/L)LAC%/图 7 吐温-80添加量对CLA转化率的影响Fig.7 EffectofTween-80concentrationontheconversionefficiencyofCLA由图7可知，吐温-80添加量对CLA转化率的影响不显著(P0.05)。使用不同种类的乳化剂，可影响CLA的转化率，吐温-80作为乳化剂对CLA转化率影响最大，则选用了吐温-80作为乳化剂17。与未使用吐温-80相比，CLA转化率有所增大。故确定吐温-80的添加量为2.0g/L。2.8响应面试验结果表 1 Box-Behnken设计方案及结果Table 1 Box-Behnken design and results试验号因素CLA转化率/%A接种量/%B培养时间/hC亚油酸添加量/ 试验值 预测值11 (2.5)1 (36) 0 (1.25) 4.82 4.772 0 (3.0) 0 (42) 0 6.93 6.883 1 (3.5) 01 (1.00) 5.37 5.424 11 0 5.04 4.955 0 0 0 6.78 6.886 0 0 0 6.88 6.8871 01 4.86 4.868 01 1 (1.50) 5.13 5.229 0 1 (48) 1 5.60 5.5610 0 11 5.43 5.3411 1 1 0 5.89 5.9412 0 0 0 7.01 6.8813 011 4.37 4.41141 1 0 4.96 5.0515 0 0 0 6.82 6.88161 0 1 5.44 5.4017 1 0 1 5.91 5.91生物工程 食品科学 2013, Vol.34, No.19 217以CLA转化率为试验指标，将3个影响因素(接种量、培养时间、亚油酸添加量)进行响应面设计。试验设计与结果见表1，方差分析结果见表2。表 2 CLA转化率响应值的方差分析Table 2 Analysis of variance for the fitted regression model变异来源 平方和 自由度均方 F PProbF模型11.85 9 1.32 118.98*0.0001A0.57 1 0.57 51.23* 0.0002B0.79 1 0.79 71.70*0.0001C0.53 1 0.53 47.45* 0.0002AB0.13 1 0.13 11.38* 0.0119AC4.0010-41 4.0010-40.036 0.8546BC0.087 1 0.087 7.86* 0.0264A22.19 1 2.19 198.260.0001B24.08 1 4.08 368.630.0001C22.48 1 2.48 223.740.0001一次项1.89 3 0.63 56.79交互项0.217 3 0.0725 6.43二次项8.75 3 2.917 263.54剩余0.077 7 0.011纯误差0.033 4 8.2310-3失拟项0.045 3 0.015 1.81 0.2858总和11.93 16注：F0.01(1,9)=10.56，F0.05(1,9)=5.12，F0.01(3,7)=8.45；*.P 0.01为极显著差异 ；*.P 0.05为显著差异。由表2可知，该模型的F值为118.98，P0.0001说明该模型是极其显著的。而失拟项的F值为1.81，P0.28580.05，表明模型失拟不显著。且该模型的R2=0.9795，R2Adj=0.9532，R2Pred=0.9359，说明该模型预测值与实验值拟合得很好，进一步证实3个因素水平设计合理，拟合方程能较好地说明情况。7.57.06.56.05.55.04.54845423936 B/h A/%CLA/%7.57.06.56.05.55.01.0 C亚油酸添加量/A/%CLA/%8765 3639424548C亚油酸/B/hCLA/%图 8 各因素交互作用对CLA转化率影响的响应面曲线图Fig.8 Response surface plots showing the interactive effects ofculturetime,inoculumamountandLAconcentrationontheconversionefficiency of CLA由Design-Expert.V.8.0.5b软件分析响应面试验设计与表1结果得出响应面图，结果见图8，显示了接种量、培养时间、LA添加量三因素之间的相互作用。由表2可知，接种量与培养时间、培养时间与LA添加量之间的交互作用显著(P0.05)，接种量与LA添加量交互作用不显著(P0.05)。采用手动优化的方式优化回归模型，根据方差分析表2，剔除差异不显著的因素交互项AC，得到CLA转化率关于接种量、培养时间、LA添加量的优化后的回归模型：Y=6.880.27A0.32B0.26C0.18AB0.15BC0.72A20.98B20.77C2。进一步通过软件分析得出，CLA转化率预测值达最高值6.96%时，菌液接种量3.1%、培养时间43.0h、LA添加量1.29。为方便实验操作，设定菌液接种量为3.0%、培养时间为43.0h、LA添加量为1.30，进行验证实验，CLA转化率为6.87%，与理论预测值6.96%基本吻合，实验值与理论预测值的相对误差为1.29%，表明该模型是有效的。3 结 论本实验探讨了经LA诱导后的乳杆菌PC-3菌细胞发酵产两种活性CLA异构体的优化条件，采用单因素试验和响应面试验设计方法，表明发酵的主要影响因素是培养时间、菌液接种量和LA添加量，确立了较佳发酵条件：诱导培养基为MRS培养基、培养时间为43.0h、菌液接种量为3.0%、LA添加量为1.30、乳化剂吐温-80添加量为2.00g/L、乳糖与硫酸铵添加量比为3:2，经LA诱导后的乳杆菌PC-3菌细胞产c9,t11-CLA和t10,c12-CLA的转化率可达6.87%。相对于菌株直接发酵和亚油酸异构酶转化方法，该优化方法具有成本较低、发酵条件易实施、易实现工业化等特点，值得开发利用。218 2013, Vol.34, No.19 食品科学 生物工程参考文献：1 刘晓华,曹郁生,陈燕.微生物生产共轭亚油酸的研究J.食品与发酵工业, 2003, 29(9): 69-72.2 任仲丽,徐尔尼,刘薇.共轭亚油酸的生理功能及微生物合成研究进展J.中国酿造, 2008(15): 4-8.3 刘霞.共轭亚油酸抗癌的安全性、有效异构体及其有效剂量J.中国临床康复, 2005(18): 212-213.4LEE K N, KRITCHEVSKY D, PARIZAA M W. Conjugated linoleicacidandatherosclerosisinrabbitsJ.Atherosclerosis,1994,108(1):19-25.5 刘晓华.生物转化制备共轭亚油酸异构体单体R.江西省科技厅:南昌华兴生物科技有限公司, 2007.6 罗玉芬,徐尔尼,巫小丹.微生物生产功能性油脂-共轭亚油酸的研究进展J.食品工业科技, 2010, 31(5): 377-380.7LUNA P, JUREZ M, de la FUENTE M A. Conjugated linoleic acidcontentandisomerdistributionduringripeninginthreevarietiesofcheesesprotectedwithdesignationoforiginJ.FoodChemistry,2007,103(4): 1465-1472.8KIM Y J, LIU R H, BOND D R, et al. Effect of linoleic acidconcentration on conjugated linoleic acid production bybutyrivibriofibrisolvens A38J. Applied and EnvironmentalMicrobiology, 2000, 66(12): 5226-5230.9KIM Y J, LIU R H,