微生物实验报告：普通染色和格兰染色.doc

实验二 细菌的分离和革兰氏染色一、 实验目的1 掌握细菌涂片标本的制备方法和普通染色的步骤；2 掌握革兰氏染色法的步骤和关键点；3 识别细菌的革兰氏染色结果；4 学习无菌操作技术 。二、 实验原理 一般认为革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。 虽然如此，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，因为酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。三、 实验器材载玻片，盖玻片，接种环，酒精灯，显微镜、擦镜纸、镜油、擦镜液；结晶紫、革氏碘染液、95%酒精、番红染液；枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和未知菌的18小时的液体培养液，酵母菌平板，大肠杆菌平板，牙垢。四、 实验步骤1、 涂片左手持菌液EP管，右手持接种环，在火上对接种环灭菌后，从EP管中取一环培养液，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈），将接种环在火焰上烧灼灭菌。若是从平板上取材，则事先在载玻片上滴一小滴水，在火焰附近把平板打开一小口，用接种环调取菌落边缘的物质涂于水滴上。室温下自然干燥。2、 固定 手持或镊子夹载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动34次，共约34秒。要求玻片温度不超过60，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。3、 初染 滴加1滴草酸铵结晶紫染液，染色1分钟，水洗，吸干。4、 媒染 用碘液冲去残留水，再加1滴碘液覆盖涂片1分钟，水洗，吸干。5、 脱色 用吸水纸吸去玻片上的残留水，滴加95%的乙醇脱色，轻轻摇动玻片，倒掉脱色液，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，吸干。脱色时间2030秒。6、 复染 滴加1滴蕃红染液复染1-3分钟以上，水洗。7、 显微镜观察吸干载玻片背面及标本周围水渍，先用4*10的倍数找到合适的视野，再油镜观察。五、 实验结果6张装片的实验结果见表1，照片见图1。表1 . 各菌种的染色结果及形态特征菌名形态特征染色结果结论枯草芽孢杆菌个体较大，呈杆状，多见成对短链状红色，G假阴性金黄色葡萄球菌个体小，球状，成团存在紫色，G符合理论大肠杆菌个体小，短棒状，分散存在红色，G符合理论未知菌个体小，球状，分散存在紫色，G未知菌为G菌酵母个体巨大，卵状，成团存在紫色，G符合理论牙垢个体小，球状，成团存在，杂质较多紫色，G牙垢中基本上为G菌 （a）枯草芽孢杆菌，10100倍放大 （b）金黄色葡萄球菌，10100倍放大 （c）大肠杆菌，10100倍放大 (d)未知菌，10100倍放大 （e）酵母，10100倍放大 （f）牙垢，10100倍放大 图1. 微生物革兰氏染色显微照片六、 讨论1 涂片时的干燥 在涂片时，如果是直接调菌液，则用接种环一蘸即可，如果是从平板菌落上取样，事先滴水时千万不要滴太大的液滴，总之是为了使涂片尽快干燥。如果不慎水加多了，不能用吸水纸吸，因为此时还没有固定，会将大部分细菌吸走。可考虑放到酒精灯上方较远处，微热干燥，以手心能感到温暖为宜。不能太低，会对细菌造成杀伤。2 固定 本次实验中较难掌握度的一步。在火焰上方约10cm处来回过34次即可。固定不充分的话后续清洗时会将细菌洗掉，固定过热的话又将细菌烧焦，不能上色。需要注意的是，热固定会改变细菌的内部结构和外形，若研究菌体细胞结构时还是要用化学固定法。3 脱色时间最难掌握度的一步！脱色时，最初洗下的酒精都看不出初染的蓝色，也就无法判断脱色是否充分，所以只能通过多次实验，建立洗脱时间梯度来逐步摸索。我们的金黄色葡萄球菌做了3次才得到勉强理想的染色结果。个人觉得用不了书上说的30s，洗2次大约15s就足够了。基础实验，我们可以根据已知的菌种知识来调节洗脱时间，比如G就洗短点，G就洗长点，但是对于以后的未知菌种，这样做是不可以而且不可能的！所以一定要在基础试验中打下扎实的革兰氏染色操作基础，标准化动作，以后才能对未知菌种做出正确鉴定。4 大肠杆菌的复染老师事先提醒过大肠杆菌不好染色，复染可延长时间。我们复染5分钟后镜检，发现染色效果不理想，于是小心地拆下盖玻片不使镜油污染样品，再次滴加蕃红染色5分钟，累计10分钟复染。第二次镜检的结果就好多了。说明我们的补救方法是可行的。另外，我们对面是几位重做实验的同学，助教为他们准备了大肠杆菌平板。一开始我们误将此板当作酵母，根本没考虑二者菌落外形的巨大差异，制片后一致在困惑酵母怎么这么小而且是阴性的（我们居然分不清菌落特征却还记得分清细菌个体），重复制片结果仍然如此！苦恼中求助助教，才发现取错样品了。拿到酵母平板后，惊叹于二者菌落外形差异如此巨大我们却没有注意到，看来上次课观察平板写完报告后就忽略了。这提醒我们即使是基础教学试验这种材料很固定的实验也要小心，自己要有判断能力，而且千万不能忘了前面的成果。值得一提的是，我们一共做了3块大肠杆菌片子（2固1液），染色都很不错，有的同学却染了一下午才得到理想结果。我们可谓“无心插柳柳成荫”了。这同时也说明，平板比液体培养基适于做染色实验。5 染色结果 这次报告中唯一不理想的染色是枯草芽孢杆菌，是我同组制作的。但是这张片子我当时看过，的的确确是紫色！这是我们第一张片子，照相前非常谨慎，请教助教鉴定后才决定拍照的，不知道为什么在数字摄影的成像系统下就失真了。肉眼观察可是千真万确的阳性结果啊本想像以前处理实验结果一样PS一下，突然意识到这次是染色实验，看的就是颜色结果，PS就毫无意义了。所以只好忍了，暂且算作假阴性吧。这再次说明，摄影技术发达的今天，肉眼仍然是不可替代的。6 酵母菌能