硫酸软骨素含量测定方法研究进展.doc

硫酸软骨素含量测定方法的研究进展摘要：综述了硫酸软骨素含量测定方法的研究进展。含量测定方法包括比色法、色谱法、电泳法、原子吸收法、比浊法、配位滴定法及免疫法等。硫酸软骨素的测定方法按其测定指标主要分为软骨素二糖、氨基己糖、葡萄糖醛酸、硫酸基和阴性基团5类。对各种含量测定方法的原理和特点进行了介绍。关键词：硫酸软骨素 高效液相色谱 醋酸纤维素薄膜电泳法 硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)系从动物软骨组织中提取、纯化所得的酸性黏多糖，具有降血脂、抗肿瘤、抗衰老、治疗关节炎、促进溃疡愈合、耳呜症及神经痛等多种作用，无明显的毒副作用。在临床具有广阔的应用前景。近年来，CS大量出口美国及欧洲，已成为出口量最大的生化医药产品之一。CS的含量测定方法有许多种，每种含量测定方法均有其特点，但测定原理均是基于其组成的糖单位(D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖)、硫酸基以及酸性黏多糖的大分子性质。在分子结构上，CS由D-葡萄糖醛酸和N-乙酞-D-氨基己糖以1, 3糖苷键连接形成重复二糖，二糖单位之间以1, 4糖苷键连接形成糖链，氨基己糖糖环的4位C或6位C可硫酸化，硫酸化后分别形成硫酸软骨素A(CS-A)和硫酸软骨素C(CS-C)。本文对CS的含量测定方法进行综述，以便对不同CS测定方法及特点有一较全面的了解。1.测定硫酸软骨素的指标物质 根据CS的分子结构特点，研究出以CS某一化学成分为测定指标的多种方法，这些指标包括软骨素二糖、氨基己糖、葡萄糖醛酸、硫酸基、阴性基团等5类。1.1 以葡萄糖醛酸为指标的测定方法 在酸性条件下降解CS，生成与其软骨素二糖单位摩尔数相等的葡萄糖醛酸，再加入咔唑、间苯三酚和4-氨基-3-肼基-5-巯基-1, 2, 4，-三唑(AHMT)等色原物质与葡萄糖醛酸显色，最后测定反应液特定波长处吸收值，以葡萄糖醛酸或CS标准品为对照制作标准曲线，转换为葡萄糖醛酸含量，根据葡萄糖醛酸与软骨素二糖之间的分子量之比换算成CS含量。1.2 以硫酸基为指标的测定方法 CS 中硫酸基的测定方法主要有离子色谱法和间接原子吸收法等。这两种方法首先以强酸降解CS生成游离硫酸基，前者以离子色谱检测经分离的反应液中的硫酸基与软骨素二糖的分子量之比计算CS含量；后者以已知过量的钡离子与降解CS产生的游离硫酸基反应，再通过原子吸收光谱法测定过量的钡离子，换算出CS样品中硫酸基含量，然后计算CS含量。1.3 以氨基己糖为指标的测定方法测定氨基己糖的经典方法是Elson-Morgan法，该方法以盐酸氨基己糖作对照品，利用盐酸水解CS释放出氨基己糖，而氨基己糖在碱性条件下先与乙酞丙酮缩合，其产物与对二甲氨基苯甲醛的醇溶液结合后显红色，于特定波长处测定吸光值，计算样品中氨基己糖含量，再根据氨基己糖与软骨素二糖单位之间的分子量之比换算成CS含量。1.4 以软骨素二糖为指标的测定方法在超声波作用下或在软骨素酶作用下使CS降解成软骨素二糖单位，记录软骨素二糖溶液经过色谱柱的洗脱曲线，将样品的出峰时间和峰面积(或峰高)与标准品比较，以此确定其含量(软骨素二糖是CS的基本组成单位，理论上其含量与CS相等)。1.5 以阴性基团为指标的测定方法 阳离子染料类方法利用CS分子上携带的羧基和硫酸基与碱性艳蓝BO,吖啶橙、维多利亚蓝B、中性红、天青A和溴化1-乙基-2-3-(1-乙萘酚噻唑-2-甲基丙烯基)萘酚-1，2-噻唑等阳离子染料通过静电力和疏水作用结合生成离子复合物，导致染料本身在特征吸收峰处吸光值改变，而吸光值改变程度与CS含量相关，因此将测得的吸光值带人由CS标准品制作的标准曲线，可计算样品CS含量。比浊法则利用乳化剂氯化十六烷基吡啶可与CS分子上阴性基团结合的特点形成乳浊液，该乳浊液在其特征吸收波长处吸光值与CS含量相关，由此测定CS含量。2. 几种测定方法介绍2.1 色谱法2.1.1 离子色谱法 茅力根据CS中硫酸根与软骨素之间的关系，将CS水解生成等摩尔的硫酸根，用Anion HC色谱柱将硫酸根与其他干扰物质分离后，以硼酸钠-葡萄糖酸钠淋洗液为流动相，流速1.5mlmin，电导检测器检测。对照物：无水硫酸钠，采用外标法检测其含量。这样使测定对象单一，准确度和回收率都较高。Plaas等将CS用CS酶ABC或Ac消化水解，产物用2-氨基吡啶和硼酸二甲胺制得糖的衍生物，然后在0500nmolL三氟乙酸梯度洗脱下经AS4A离子交换柱分离，荧光法定量。该法衍生物制备重复性和稳定性好，色谱系统灵敏度高。David等将CS用软骨骨素酶ACH酶解后。利用离子对液相色谱进行了CS的含量测定，检测波长240 nm，梯度洗脱，该法精确度高、重现性好、专属性强。2.1.2 化学发光高效液相色谱法 Akiyama等用化学发光高效液相色谱法，先将CS用CS酶ABC或CS酶ACII降解，然后用酰胺-80-二氧化硅色谱柱(250mm4.0mm)反相色谱进行分离，用l mmolL草酸盐和3 mmolL过氧化氢洗脱，电导检测器检测。该方法特别适用于临床生理检测。2.1.3 酶解-高效液相色谱法 CS钠在硫酸软骨素ABC酶作用下，酶解为三种不饱和的二糖。用强阴离子交换硅胶为填充剂，以水(用稀盐酸调节pH值至3.5)为流动相A，以2 molL氯化钠溶液(用稀盐酸调节pH值至3.5)为流动相B，进行线性梯度洗脱。流速为1.0 mLmin，检测波长为232 nm。用CS钠对照品作为对照，按外标法以3种不饱和二糖的面积之和计算，即得。该法准确度、精确度、专属性都很好。2.1.4 HPLC-ELSD法林燕飞引用HPLC-ELSD法，以乙腈-水-三乙胺溶液(10：90：0.1)为流动相，用ODS色谱柱，蒸发光散射检测器，测定复方氨基葡萄糖片中CS的含量。该法能避免盐酸氨基葡糖对CS测定的干扰，有着良好的精密度、重复性和回收率。2.1.5 其他色谱法有反相离子对高效液相色谱法、吸附高效液相色谱法等。另外，国内一些生化厂总结多年工作经验，利用凝胶柱，以1.42、pH6.8的磷酸二氧钠为流动相，波长206nm紫外检测，并以对照品对照制作标准曲线，利用组分峰面积或峰高与对照品进行比较。缺点是分辨率较差，杂质容易产生干扰。2.2 比色法2.2.1 氨基己糖的测定 该法又称Elson-Morgan法，是CS部颁药品标准采用的方法。测定原理是基于CS由D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-氯基半乳糖组成，经盐酸水解可释放出氨基葡糖，在碱性条件下与乙酰丙酮缩合，产物与对二甲氨基苯甲醛的酸醇溶液呈红色，于波长525 nm处测定吸收度，以氨基葡糖作对照品，计算氨基葡糖含量，再换算成CS含量。该方法操作繁琐，最棘手的是重现性差。谢继青等对此法进行析因实验设计，对比实验。发现影响最终测定结果的关键步骤有乙酰化和显色两步，测定时按乙酰化同时计时、显色剂随加随计时操作，所得结果精密度高、重现性好。谢继青等对卫生部药品标准中的方法进行了优化，发现保温时间的长短及冷却的快慢都会影响含量测定的结果，注意做到冰浴乙酰化同时计时，显色随加随计时，使测定结果的精密度、重现性都得到提高。2.2.2 己糖醛酸的测定该法又称咔唑法，测定原理是CS分子中的D-葡糖醛酸在硫酸作用下生成糠醛，后者在咔唑的醇溶液中显红色。于波长530nm测定吸收度，制作标准曲线计算出D-葡糖醛酸含量，再换算成CS含量。该法较测定氨基葡糖法简单一些，但由于在操作过程中有浓硫酸，所以给实际操作带来诸多不便。2.2.3 染色法 原理是具有大分子聚阴离子性质的黏多糖与荷正电碱性染料天青A在一定pH条件下结合产生与原来染料不同的颜色，并以黏多糖本身作对照，通过测定在波长505nm的吸收度定量。由于天青A对不同的黏多糖选择性不强，测定结果容易受其他黏多糖的影响。2.3 电泳法2.3.1 琼脂糖凝胶电泳法 Volpi利用黏多糖中的“快移动”片段和“慢移动”片段性质的不同，以及不同黏多糖中二者比例不同，首先用细菌酶降解，然后用琼脂糖凝胶电泳分离分析，标准曲线分光光度法定量。该方法多用于实验室小量供试品定性及定量。2.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳法Lyon等利用CS的黏多糖性质进行梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳，供试品可降解也可不降解，用天青A-银氨试剂染色进行定量，属半微量分析，检测灵敏度l2 ng，几乎可用于所有黏多糖的分离分析。Moller等将该方法加以改进，首先采用高碘酸氧化，然后天青A染色，最后用硝酸银滴定进行定量。该方法多用于实验室小量供试品的分析、定量。2.3.3 醋酸纤维素薄膜电泳法 Gafen等把供试品先用CS酶ABC消化，然后经醋酸纤维素薄膜电泳分离，红斑印迹检测：该方法检测灵敏度可达2ng，还可以消除核酸和玻璃酸的影响。2.4 电位法本方法中硫酸软骨素在一定浓度范围内呈良好的线性关系，加收率高。无干扰，可作为硫酸软骨素的含量测定方法。2.5 原子吸收法 茅力等利用间接原子吸收法测定鲨鱼软骨粉中CS的含量。利用CS完全水解释放出等摩尔的硫酸根，钡离子过量定量，用原子吸收法直接测定过量的钡含量，求算总硫酸根与游离硫酸根，得出有机硫酸根，间接换算出CS的含量。2.6 光度滴定法徐志洲等建立了光度滴定法快速测定CS含量的新方法。该方法利用CS可与CPC结合生成稳定乳浊液的性质用光电极在420 nm波长处指示终点进而测定CS的真实含量。该法中，CS在一定浓度范围内呈良好的线性关系，加样回收率高、无干扰，并且样品溶解后不需要水解即可直接测定，操作简便快捷，测定结果重现性好。此法还可以有效控制非法添加氨基己糖来提高CS的含量。2.7 配位滴定法通过将CS水解，释放出硫酸根，氯化钡标准溶液配位滴定法测定，剩余钡离子用EDTA滴定，求算硫酸根含量，最后根据硫酸根与软骨素结构单位的关系计算CS的含量。该法简单，但需严格控制温度。3.前景展望 CS是重要的生化药物，因其特有的生物活性而广泛应用于临床。综上所